胸膜肺炎放线杆菌硫转运关键基因的功能及其致病性研究

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胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillu spleuropnumoniae,APP)是革兰氏阴性病原菌,可引发猪胸膜肺炎(porcinepleuropneumonia)。猪胸膜肺炎的高传染性及高致死率,给中国乃至全世界的经济造成了巨大损失。硫是许多微生物的必需营养素,它作为许多基本有机分子的成分在细胞中发挥关键作用,硫也参与了能量转导、氧化还原稳态等多个细胞过程,此外,硫代谢途径对于许多病原菌的存活和毒力的表达至关重要。APP作为一种侵入性病原菌,其毒力与养分利用系统有关。但是,人们对于APP硫代谢及作用了解很少。因此,为了进一步阐明APP的致病机理和生物学特性,本研究对APP硫转运途径中的Sbp、FliY和YdjN的功能进行了初步研究。现将研究过程及主要结论做如下简述:1.分析sbp突变株的体外生长特性以APP血清7型菌株WF83为亲本菌,通过同源重组和负向筛选法,成功构建了sbp突变株Δsbp;通过电转化和抗性筛选法,将sbp基因导入Δsbp菌株中,构建回复突变株C-Δsbp。将WF83、Δsbp和C-△sbp接种于TSB和含不同硫源的化学限制性培养基(chemically defined medium,CDM)中,测定生长曲线,分析Sbp对APP生长水平的影响。结果显示,Δsbp在TSB中生长能力下降;在仅含硫酸盐或甲硫氨酸的CDM中,Δsbp几乎无生长,而亲本菌和回复突变株保持正常生长水平。2.研究Sbp对APP的致病性本研究通过测定WF83、Δsbp和C-Δsbp对Balb/C小鼠的半数致死量(LD50)、急性感染致死量和小鼠肺组织带菌量,分析WF83和Δsbp在猪肺部竞争感染指数,来综合评估sbp对APP的毒力是否有影响。结果显示,WF83、Δsbp和C-△sbp的半数致死量差异不大;小鼠肺组织载菌量差异也不显著;猪肺部竞争感染指数远高于致弱临界值,表明缺失Sbp对APP的致病性没有显著影响。3.研究FliY和YdjN的功能以WF83为亲本,分别构建了fliY、ydjN单基因缺失突变株ΔfliY和ΔydjN;然后以ΔydjN为亲本,构建fliY、ydjN双基因缺失突变株ΔfliYΔydjN。测定了ΔfliY、ΔydjN、ΔfliYΔydjN在TSB培养基中及硫限制培养基中的生长特性;分析了 WF83、ΔfliYΔydjN在小鼠的肺组织带菌量以及小鼠肺部竞争感染指数。结果显示,无论是单缺失FliY、YdjN还是双缺失菌株均不影响APP在TSB培养基中的生长能力,但化学限制培养显示,双缺失突变株丧失利用胱氨酸和半胱氨酸的能力,该摄取过程不需要硫胺素的参与,而硫胺素对硫酸盐和甲硫氨酸的摄取是必需的,但硫胺素能显著促进APP对半胱氨酸和胱氨酸的利用;△fliYΔydjN在小鼠肺组织定植能力显著下降;小鼠肺部竞争感染指数为0.22,略高于致弱临界值0.2,提示双缺失FliY和YdjN可能会显著降低APP的致病性,胱氨酸和半胱氨酸的摄取可能是APP的致病因素。通过本研究,初步确定了 Sbp、FliY和YdjN在APP硫元素利用中的特点以及对细菌致病性的影响。硫是APP生长的必要营养素,APP能以多种途径获得硫营养:Sbp负责硫酸盐、甲硫氨酸的利用,FliY和YdjN以协同作用的方式负责胱氨酸和半胱氨酸的摄取。虽然单独缺失了 Sbp的APP致病性没有下降,但是FliY和YdjN双缺失能降低APP对小鼠的致病性,可见硫营养(胱氨酸和半胱氨酸)的获得很可能是APP感染的关键因素之一。本研究为今后进一步研究APP的硫代谢及猪胸膜肺炎的控制提供了理论依据。
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