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一、建立氧糖剥夺/复氧离体神经元模型目的原代培养获得纯化的小鼠脑皮层神经元,在细胞水平建立一种可靠的、简便易行的离体神经元氧糖剥夺/复氧(OGD/R)模型,为研究神经元缺血性损伤机制及进行药物筛选奠定基础。方法选择14-15 d Balb/c胎鼠作为大脑皮层神经元的来源,采用酶消化法获得脑皮层神经元。首先在含20%胎牛血清的DMEM中,于37℃、5%CO2孵箱中体外培养,24 h后换为含有神经元培养添加剂B27 (2%)的无血清DMEM继续培养,以促进神经元的分化及抑制神经胶质细胞的增生。倒置显微镜观察细胞形态。10 d时采用免疫荧光染色法进行β-tubulin染色,鉴定神经元纯度。体外培养10 d左右即可用于OGD/R试验。OGD 4 h后复氧20 h,然后进行细胞活力测定。采用台盼蓝(TB)染色检测细胞存活率,通过检测培养液中乳酸脱氢酶(LDH)的漏出率评估细胞膜通透性改变,反映细胞的损伤程度,从病理生理学角度阐明神经元损伤的状况。结果神经元体外培养10 d,光镜下可见成熟神经元特征,如细胞核饱满、清晰、透亮,核仁明显,核膜清晰可见,胞体呈多形性,胞质透亮,细胞具有折光性,自胞体伸出较多突起,神经元突起间相互联系,形成复杂的网络结构。β-tubulin免疫荧光染色细胞阳性率达70%。TB染色结果显示,OGD 4 h可引起明显的神经元死亡,且稳定性较好。LDH漏出率结果与TB染色结果相一致。结论采用酶消化法可分离获得小鼠大脑皮层神经元,B27不但可诱导神经元体外分化,还可有效抑制胶质细胞的增生。OGD 4 h/R 20 h可引起明显的神经元损伤,死亡率达50%,且较稳定,适宜作为脑缺血再灌注损伤的体外研究对照模型。二、短暂性OGD/R致神经元损伤时白藜芦醇(Res)的保护作用及对基质金属蛋白酶9(MMP-9)表达的影响目的在体外验证Res对短暂性OGD/R神经元损伤的保护作用,进一步在细胞水平探讨Res对脑缺血再灌注损伤的保护作用机制,即其对原代皮层神经元MMP-9表达的影响。方法以小鼠大脑皮层原代神经元OGD 4 h/R 20 h模型为研究对照。Res溶于DMSO,储液浓度为0.1 M。实验时用PBS将储液稀释到所需浓度后加入培养基,终浓度分别为2.5μM、5μM和10μM,对照组加入等体积DMSO(0.1%),治疗时间从缺氧开始,直至试验结束。TB染色法计算细胞存活率,LDH漏出率评估细胞的损伤程度。提取培养细胞总蛋白,采用Western blot分析过氧化物增殖活化剂受体(PPAR)α、γ和MMP-9的蛋白表达,提取培养细胞总RNA,采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测MMP-9 mRNA水平。结果TB染色结果显示,OGD 4 h/R 20 h可引起约50%神经元死亡,0.1% DMSO并没有加重神经元的损害。而Res干预治疗可减少这种条件下神经元的死亡,而且这种保护作用具有明显的剂量依赖效应,5μM、10μM的Res对于离体神经元OGD/R损伤具有良好保护作用,没有发现明显的副作用。Western blot和RT-PCR结果显示,正常神经元MMP-9的表达水平很低,PPAR-α和PPAR-γ的表达水平也很低。OGD 4 h/R 20 h可显著提高神经元MMP-9的转录和翻译,同时也明显激活PPAR-α和PPAR-γ的表达。加用Res后,MMP-9的转录和翻译被明显抑制,同时,PPAR-α和PPAR-γ的表达水平进一步上调,而且Res的上述作用随其浓度的增加而增强。结论Res可以抑制OGD/R模型神经元MMP-9的转录和翻译,同时激活PPAR-α和PPAR-γ的表达,而且Res的上述作用随其浓度的增加而增强。三、Res对OGD/R神经元损伤的保护作用机理探讨目的体外研究探讨Res对OGD/R神经元损伤的保护作用机理。方法以小鼠大脑皮层原代神经元OGD 4 h/R 20 h模型为研究对照。将神经元分成不同的治疗组,分别加入不同的药物进行治疗。药物分别溶于DMSO制成母液,-20℃保存。然后按照不同的剂量和组合加入培养基。包括Res(10μM)、选择性PPAR-γ激动剂troglitazone(5μM)、选择性PPAR-α激动剂wy14643(5μM)、选择性PPAR-γ抑制剂GW9662(10μM)和选择性PPAR-α抑制剂MK886(10μM)。TB染色法计算细胞存活率,LDH漏出率评估细胞的损伤程度。提取培养细胞总蛋白,采用Western blot分析PPAR-α、PPAR-γ和MMP-9的蛋白表达,提取培养细胞总RNA,采用RT-PCR检测MMP-9 mRNA含量。结果TB染色结果显示,OGD 4 h/R 20 h可引起约50%神经元死亡,0.1% DMSO并没有加重神经元的损害。Res、troglitazone和wy14643干预治疗可减少这种条件下神经元的死亡。Western blot和RT-PCR结果显示,Res、troglitazone和和wy14643都能不同程度的抑制OGD/R条件下增高的MMP-9的表达。但是加入GW9662或MK886与上述激动剂共培养后,troglitazone和wy14643对MMP-9的抑制作用及对神经元的保护作用被不同程度的阻断。Res对MMP-9的抑制作用及对神经元的保护也被MK886部分阻断,但是GW9662对Res的上述作用基本没有影响。结论Res对MMP-9的抑制作用及对神经元的保护作用与选择性激活PPAR-α有关,阻断PPAR-α的激活可以部分影响Res对MMP-9和神经元的生理作用。虽然Res和troglitazone都能激活PPAR-γ的表达,但是对PPAR-γ的下游靶点产生的生理作用并不完全一致,这可能与PPARs的结构复杂性有关。