耳聋病因学特点复杂，遗传和／或环境因素均可致聋。130个耳聋相关基因座位的发现为我们了解听觉的病理生理机制提供了新的视点。然而，最近的研究表明在中国相当一部分综合征性和非综合征性耳聋仅由为数不多的几个基因突变导致。为了解中国感音神经性耳聋群体的病因学特点，明确中国耳聋人群的常见致病基因，探讨遗传因素在耳聋发病中的比例，本课题着重进行中国重度-极重度感音神经性耳聋人群的常见基因分子流行病学及致病机制研究，为完善耳聋基因诊断的程序和方法提供依据。第一部分中国人重度-极重度耳聋分子流行病学及致病机制研究一．内蒙古赤峰地区重度-极重度耳聋患者病因学分析本部分对赤峰地区特教学校134例重度-极重度感音神经性耳聋学生进行了GJB2、GJB3、GJB6、SLC26A4、mtDNA 12SrRNA和tRNASer^UCN序列分析，并对携带SLC26A4突变的个体回访进行颞骨CT检查。结合耳聋病史、家族史、氨基糖甙类药物应用史及基因筛查结果分析该校耳聋学生的病因。研究发现，该校与遗传因素有关的耳聋比例为60.44％（81／134），其中明确病因的遗传性耳聋的比例为33.58％（45／134）。GJB2突变是赤峰地区特教学校17.16％（23／134）耳聋学生的病因，与药物性耳聋相关的线粒体基因1555A＞G突变是该校0.76％（1／134）耳聋学生的病因，通过SLC26A4序列分析结合内耳影像学检查，诊断前庭水管扩大和／或内耳畸形患者20例，为该校14.93％耳聋学生明确了分子病因。此外，还有13.43％（18／134）的耳聋学生携带GJB2单杂合突变，其耳聋可能与之有关；6.72％（9／134）的耳聋学生携带SLC26A4单杂合突变，这部分患者颞骨CT检查未发现前庭水管扩大或因故未能进行颞骨CT检查，不排除其耳聋与SLC26A4相关的可能；2.24％（3／134）的耳聋学生携带线粒体12SrRNA 1095T＞C突变，该突变与药物性耳聋有关，很可能是导致患者耳聋的病因。我们的结果反映该地区遗传性耳聋比例较高，耳聋基因诊断在明确耳聋病因方面具有优势和意义。我们首次建立了SLC26A4筛查先于内耳影像学检查诊断前庭水管扩大病例的模式，为在全国范围开展与SLC26A4相关的大前庭水管、内耳畸形、Pendred综合征的分子流行病学调查奠定了基础。二．中国重度-极重度耳聋人群SLC26A4突变分析SLC26A4突变可导致常染色体隐性耳聋DFNB4和Pendred综合征（前庭水管扩大或伴内耳畸形、神经性聋和甲状腺肿）。为了解SLC26A4在中国重度-极重度耳聋人群的突变情况及其与耳聋的关系，本部分在来自全国27个省巾自治区的聋哑学校，共计2352例重度-极重度感音神经性耳聋患者中进行SLC26A4热点突变区域：外显子7+8，19和10的筛查，对其中检测到的携带单杂合突变的个体进行全序列筛查、测序，寻找可能存在的另外的突变。共发现SLC26A4 85种突变类型，58种为尚未见报道的类型；明确中国人群SLC26A4热点突变为IVS7-2A＞G和2168A＞G；SLC26A4总突变检出率14.54％，纯合突变检出率4.93％，复合杂合突变检出率5.61％，单杂合突变检出率4.00％；占中国人口最多的汉族总突变检出率16.55％，纯合突变检出率5.68％，复合杂合突变检出率6.46％，单杂合突变检出率4.41％。SLC26A4突变检出率在中国各主要民族和不同地区的耳聋人群中存在差异；SLC26A4突变图谱在中国各主要民族的耳聋人群中存在差异。通过SLC26A4外显子7+8，19和10的筛查，初步估计中国汉族重度-极重度耳聋人群中前庭水管扩大患者至少占11.54％。本部分研究制定了SLC26A4初筛策略，绘制了包含主要民族和地域信息的中国人群SLC26A4突变和多态性图谱，为下一步对所有携带SLC26A4突变的个体进行内耳影像学检查，分析基因型表型相关性、明确SLC26A4病理性突变的诊断标准奠定了坚实的基础；为研制SLC26A4诊断芯片提供了科学的基因突变频率数据。三．中国重度-极重度耳聋人群GJB6突变研究GJB6编码连接蛋白30（Connexin30，Cx30），最常见的突变是342kb大片段缺失del（GJB6-D13S1830），del（GJB6-D13S1830）纯合缺失或与GJB2单等位基因突变共存的杂合缺失会导致感音神经性耳聋。本部分探讨中国人群GJB6突变情况，对372例重度-极重度耳聋患者（其中295例分子病因不明，77例携带GJB2病理性单等位基因突变）和182例正常对照进行GJB6 del（GJB6-D13S1830）突变检测和GJB6编码区测序。在372例耳聋患者中未发现GJB6 del（GJB6-D13S1830），发现1例携带GJB6点突变404C＞A，导致了氨基酸的错义改变T135K；正常对照中1例携带点突变446C＞T，导致了氨基酸的错义改变A149V。研究提示：GJB6突变在中国耳聋人群中整体发生频率较低，可暂不列为一线耳聋基因检测项目。四．GJB3在携带GJB2单等位基因突变的中国耳聋人群的突变分析GJB3编码连接蛋白31（Connexin31，Cx31）是我国本土克隆和鉴定的第一个耳聋致病基因。GJB3突变可以引起常染色体显性或隐性耳聋。西方人群中已有GJB2与GJB6以双基因模式遗传联合致聋的报道，为了解GJB2与GJB3是否会以双基因模式遗传导致耳聋发生，本部分对来自全国24个省市3323例耳聋患者中检测到的108例携带GJB2病理性单等位基因突变的耳聋患者和100例正常对照进行了GJB3基因编码区序列分析。耳聋组发现5例分别携带一种GJB3的错义变异：V84I，A194T，N166S。结合对照组检测结果，我们认为V84I和A194T为中国人群GJB3的多态改变，N166S可能是导致常染色体隐性非综合征性耳聋的病理性突变。携带GJB3 N166S突变的病人同时携带GJB2 235delC突变，两个突变分别位于两条等位基因上，GJB3和GJB2可能共同参与该病人耳聋的发病，但关于GJB2与GJB3以双基因模式遗传导致耳聋的观点还需进一步探讨，其机制也待研究。第二部分实时荧光定量Taqman探针法检测线粒体基因1555A＞G、1494C＞T突变技术的建立及应用研究自从1944年氨基糖甙类抗生素问世以来，由该类药物导致的不可逆的感音神经性耳聋就一直困扰着临床医生。直到1993年科学家发现线粒体DNA1555A＞G突变是导致携带此突变的个体对氨基糖甙类抗生素高度敏感而使听觉细胞功能障碍继而产生耳聋的主要因素，对母系遗传药物性耳聋的病因学研究才有了突破性的进展。线粒体DNA 1494C＞T突变是2004年明确的又一可以由氨基糖甙类药物单次剂量应用导致耳聋的线粒体基因突变类型。为减少氨基糖甙类抗生素相关性遗传性耳聋的发牛，关键环节在于通过筛查，检测发现携带线粒体DNA 1555A＞G或1494C＞T突变的个体，绝对禁止携带此类突变的个体接触氨基糖甙类抗生素，从而避免严重的耳毒性反应发生。本部分利用实时荧光定量Taqman探针技术在等位基因分型方面的优势重点探讨建立筛查线粒体DNA 1555A＞G和1494C＞T突变的新方法，实现更快速、简便、准确筛查这两种突变的目标。分别设计针对线粒体DNA 1555A＞G和1494C＞T突变的探针和引物，摸索并建立稳定的检测方法，对检测方法进行可靠性验证。实时荧光定量Taqman探针技术检测1555A＞G、1494C＞T突变的方法具有检测结果准确直观、简单省时（反应时间分别由原来的6小时和12小时缩短到1.5小时），特异性强，敏感性高的优点，适用于对母系遗传性耳聋线粒体DNA 1555A＞G、1494C＞T突变的大规模筛查或预防性检查。为在全国范围内实行母系遗传线粒体DNA 1555A＞G、1494C＞T突变的筛查和氨基糖甙类抗生素应用前预防性检测提供了便利条件。