论文部分内容阅读
目的:研究脓毒症情况下大鼠产生骨骼肌功能障碍,以及神经肌肉接头(neuromuscular junction,NMJ)突触后膜上烟碱型乙酰胆碱受体(nicotinic acetylcholine receptor,n ACh R)产生异化重构现象的机制,验证聚集蛋白agrin通过影响agrin/Mu SK(muscle-specific kinase,Mu SK)信号通路改善乙酰胆碱受体异化重构的现象并减轻神经肌肉功能障碍。方法:选取2-3月龄健康成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠,体重250-280g。采用随机数字表法将大鼠分为3组,每组各12只大鼠,即对照组(Control组),假手术组(Sham组)和脓毒症组(CLP组)。脓毒症组采用盲肠结扎穿孔(cecal ligation and puncture,CLP)术建立脓毒症模型,假手术组仅暴露腹腔并探查后逐层缝合,建模后24 h进行相应检测以及取材。采用ELISA法检测大鼠血浆中白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)水平来反映体内炎症状态;采用复合肌肉动作电位(compound muscle action potential,CMAP)衡量神经肌肉功能,测量其振幅、持续时间、潜伏期以及神经肌肉传导速度;通过免疫荧光法观测γ-n ACh R和α7-n ACh R在大鼠胫前肌表面分布情况;采用q RT-PCR检测大鼠胫前肌内烟碱型乙酰胆碱受体γ亚基和α7亚基的转录水平;采用western blot法测定大鼠胫前肌中agrin、Mu SK、rapsyn、γ-n ACh R、α7-n ACh R和ε-n AChR的蛋白表达量。另取相同月龄及体重的SD大鼠24只,建立脓毒症模型后分为2组,即生理盐水组(CLP+S)和agrin组(CLP+A)。在建模后立即给予0.1 ml agrin蛋白溶液(100μg/ml)双侧胫前肌内注射,生理盐水组则注射等体积的生理盐水。两组在建模24 h后采用与第一部分相同的方法进行检测相同指标。结果:第一部分(1)大鼠血浆中炎症因子的比较:与Control组和Sham组相比,CLP组IL-6和TNF-α的表达水平明显提升,其差异有统计学意义(P<0.05)。(2)CMAP相关检测指标的比较:与Control组和Sham组相比,CLP组大鼠CMAP振幅和神经传导速度减低,而其持续时间和潜伏期增长,差异有统计学意义(P<0.05)。(3)免疫荧光法检测大鼠胫前肌γ-n ACh R和α7-n ACh R的分布表达:与Control组和Sham组相比,CLP组大鼠胫前肌组织中γ-n ACh R和α7-n ACh R的荧光表达显著增强,分布增加。(4)γ亚基和α7亚基转录水平的比较:与Control组和Sham组相比,CLP组大鼠胫前肌组织中Chrng和Chrna7基因的转录水平显著提升,差异有统计学意义(P<0.05)。(5)各项蛋白表达情况的比较:与Control组和Sham组相比,CLP组大鼠胫前肌组织中γ-n ACh R、α7-n ACh R和ε-n ACh R的蛋白表达量均表现出不同程度的增加,agrin的蛋白表达量减低,Mu SK和rapsyn表达量增加,差异有统计学意义(P<0.05)。第二部分(1)大鼠血浆中炎症因子的比较:与生理盐水组相比,CLP+A组IL-6和TNF-α的表达水平没有显著变化,两者的差异没有统计学意义(P>0.05)。(2)CMAP相关检测指标的比较:与生理盐水组相比,CLP+A组大鼠CMAP振幅和神经传导速度增加,而其持续时间和潜伏期缩短,差异有统计学意义(P<0.05)。(3)免疫荧光法检测大鼠胫前肌γ-n ACh R和α7-n ACh R的分布表达:与生理盐水组相比,CLP+A组大鼠胫前肌组织中γ-n ACh R和α7-n ACh R的荧光表达降低,分布减少。(4)γ亚基和α7亚基转录水平的比较:与生理盐水组相比,CLP+A组大鼠胫前肌组织中Chrng和Chrna7基因的转录水平降低,差异有统计学意义(P<0.05)。(5)各项蛋白表达情况的比较:与生理盐水组相比,CLP+A组大鼠胫前肌组织中γ-n ACh R、α7-n ACh R和ε-n ACh R的蛋白表达量降低,agrin的蛋白含量上升,Mu SK和rapsyn表达量下降,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:(1)脓毒症情况下大鼠骨骼肌异常的agrin/Mu SK信号通路改变,可能与神经肌肉功能障碍以及烟碱型乙酰胆碱受体异化重构有关。(2)给予大鼠神经源性agrin可以通过调节其相关信号通路减少骨骼肌异质化乙酰胆碱受体的表达及相关亚基的转录,并减轻神经肌肉功能障碍。