艾灸对帕金森病模型大鼠脑黑质PINK1/Parkin通路的影响研究

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目的:此实验研究将颈背部皮下注射鱼藤酮制作的帕金森病(PD)模型大鼠作为研究对象,依据中医基础理论的指导思想和现代医学病理学理论,观察艾灸“风府”、“关元”、“足三里”穴对PD模型大鼠脑黑质PINK1/Parkin通路的影响。以此为契机,探讨艾灸预防和治疗PD的可能作用机制,并为临床艾灸预防和治疗PD提供更多的实验依据。方法:将40只SPF级健康雄性SD大鼠(体重为200±20g)置于动物房屏障系统中进行适应性喂养2周。2周后,根据随机数字表完全随机抽选16只大鼠并避免任何影响因素随机分为正常组8只和假手术组8只,余下大鼠24只归属造模组。将1g鱼藤酮用玻璃棒充分捣碎,溶解于二甲基亚砜(DMSO)和0.9%NaCl混合溶液中(DMSO与0.9%NaCl的体积比为7:1),定容后含有鱼藤酮的混合溶液最终溶度为1mg/mL,制备的溶液用棕色瓶低温密封保存。造模组大鼠采用颈背部皮下注射鱼藤酮溶液造模(按照1mg/kg),1次/天,持续40天。假手术组采用颈背部皮下注射相同量但不含鱼藤酮的DMSO和0.9%NaCl混合溶液,1次/天,持续40天。正常组正常饲养,不作任何处理。造模40天后,依据陈忻等行为学评分标准对造模组大鼠进行记录并筛选,选择行为学评分2分~8分的大鼠14只。第二天,从正常组、假手术组、造模组分别随机抽取2只大鼠灌注切片处理,选择免疫组化法用于检测大鼠脑黑质酪氨酸羟化酶(TH)和α-突触核蛋白(α-syn)的表达,以进一步确定造模是否成功。通过行为学评分鉴定和免疫组化法检测大鼠脑黑质TH和α-syn后,将造模组剩余的12只大鼠再随机分为PD模型组、艾灸治疗组。在艾灸治疗阶段,正常组、假手术组和PD模型组大鼠不加干预因素,每天相同时间同艾灸治疗组抓取,穿鼠衣固定。艾灸治疗组取“风府”、“关元”、“足三里”穴,选用7mm艾灸条,每天相同时间点施灸,1次/天,每穴艾灸15分钟,7天为1个疗程,共2个疗程。治疗结束后,再次对各组大鼠进行行为学评分,第二天进行大鼠取材。组织匀浆处理后,采用免疫蛋白印迹法(Western blotting)检测大鼠脑黑质PINK1、Parkin的蛋白表达量,通过实时荧光定量法(RT-PCR)检测各组大鼠脑黑质PINK1mRNA、ParkinmRNA相对表达量。结果:(1)在造模阶段,造模组大鼠行为学评分显著高于正常组和假手术组(P<0.01);在艾灸治疗阶段,艾灸治疗组大鼠行为学评分显著低于PD模型组(P<0.01),在正常组和假手术组中没有观察到行为学评分显著的变化。(2)造模结束后,免疫组化法检测示造模组较正常组、假手术组TH染色丢失明显,分布不均;与正常组、假手术组相比,造模组α-syn染色更加丰富致密。(3)Western blotting显示PD模型组大鼠脑黑质PINK1、Parkin表达量显著低于正常组和假手术组(P<0.05);与PD模型组相比,艾灸治疗组大鼠脑黑质PINK1、Parkin表达量显著增加(P<0.05)。(4)RT-PCR示PD模型组较正常组、假手术组大鼠脑黑质PINK1mRNA、ParkinmRNA相对表达量显著降低(P<0.05);与PD模型组相比,艾灸治疗组大鼠脑黑质PINK1mRNA、ParkinmRNA相对表达量显著增加(P<0.05)。结论:(1)此实验研究再次验证颈背部皮下注射鱼藤酮可以有效复制PD大鼠模型。(2)鱼藤酮制备的PD大鼠模型出现PD病理变化,即脑黑质TH表达显著减少,α-syn表达显著增加。(3)艾灸治疗作用下PD模型大鼠可显著改善大鼠行为学和外观的表现。(4)艾灸治疗作用下PD模型大鼠脑黑质PINK1、Parkin蛋白表达显著增加,PINK1mRNA、ParkinmRNA相对表达量显著增加,这很可能是由于线粒体自噬水平增强,降解相关病理蛋白的能力得以提升,减少了病理蛋白聚集,这可能是艾灸治疗帕金森病作用机制之一。
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