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肥胖作为人类疾病的第六位危险因素,不仅降低生活质量,更是诱发心血管疾病、Ⅱ型糖尿病乃至癌症等慢性疾病的罪魁祸首。肥胖主要是由于机体能量的长期摄入大于消耗,多余的能量以甘油三酯的形式储存在脂肪组织中而导致。现在,脂肪细胞主要分为两大类:白色脂肪细胞与褐色脂肪细胞。其中褐色脂肪细胞又可以被细分为两类:经典的褐色脂肪细胞与beige脂肪细胞(也称米色脂肪细胞)。褐色脂肪细胞不同于白色脂肪细胞的主要特征是:其线粒体内膜上的解偶联蛋白1(Ucp1)的表达量很高。所以,褐色脂肪细胞的主要功能就是通过Ucp1来产热从而消耗能量而不产生ATP。褐色脂肪细胞的非颤栗性产热功能,可以维持体温恒定,也可以以热能的方式消耗机体摄入的能量,从而降低肥胖发生的概率。而这两种褐色脂肪细胞的来源是不同的,经典的褐色脂肪细胞与肌肉细胞同源,但是米色脂肪细胞存于白色脂肪组织中。已有的研究发现,在一定条件下,如冷冻、特定基因的敲除或者视黄酸(retinoid acid,RA)、成纤维细胞生长因子21(FGF21)等药物的刺激,米色脂肪细胞可以由白色脂肪细胞转分化而来。所以米色脂肪细胞受到广泛关注,它的研究对于人类肥胖相关代谢疾病的治疗具有重大意义。基于此,我们迫切希望找到能够促进白色脂肪细胞褐色化的新的小分子化合物。为了寻找促进白色脂肪细胞褐色化的新的小分子化合物,我们利用本实验室已构建的Ucp1-2A-luciferase小鼠模型。简单来说,该小鼠模型是通过在Ucp1基因的最后一个外显子后面直接串联荧光素酶基因,使得荧光素酶基因能与Ucp1基因共同表达和翻译,最终达到通过测定荧光素酶的活性来真实准确的反应Ucp1蛋白表达水平的目的。通过从Ucp1-2A-luciferase小鼠中分离出的腹股沟脂肪间充质干细胞,并在体外培养分化为成熟脂肪细胞这一细胞模型,我们筛选了到了一个新的能够促进白色脂肪细胞褐色化的小分子化合物:Linifanib。随后,我们在体内和体外进行了以下三个方面的研究:首先,为了确定Linifanib是否在体内体外都能够有促进褐色化的作用,我们先利用从Ucp1-2A-luciferase小鼠腹股沟分离的脂肪间充质干细胞,体外培养分化为成熟的脂肪细胞,然后加不同浓度的Linifanib处理24h后检测荧光素酶活力,结果显示Linifanib处理后,Ucp1的表达以剂量依赖性的方式升高,之后我们又做了qPCR和Western blot实验,检测Ucp1在mRNA水平和蛋白水平的表达情况,结果与之前的实验一致。同时我们又检测了Linifanib处理后其它产热相关基因的表达,结果显示这些产热基因的表达均被上调了。随后,我们又做了氧消耗实验、甘油释放量检测实验、线粒体相关蛋白检测,实验结果表明,Linifanib增加了细胞的基础呼吸和最大呼吸、增加了细胞中的线粒体含量和甘油释放量。接下来,我们想要探索Linifanib在体内是否也发挥着同样的作用。我们利用Ucp1-2A-luciferase小鼠,给小鼠灌胃Linifanib处理,然后检测小鼠经典褐色脂肪组织和腹股沟白色脂肪组织中的荧光素酶活性,实验表明,通过Linifanib处理,Ucp1在经典褐色脂肪组织和腹股沟白色脂肪组织中的表达均有升高。接着,为了探索Linifanib的作用靶点,我们检测了Linifanib对各种蛋白激酶(如STAT3,P38,ERK和AMPK)信号通路的影响,这些蛋白激酶在已有的报道中都是可增强Ucp1表达的。结果显示,Linifanib使STAT3的磷酸化显著减弱,而其他三种信号传导途径未受影响。之后,我们进一步检测了这些信号通路是否影响Linifanib诱导的白色脂肪细胞褐色化,我们又选择了这些激酶的其他激动剂或拮抗剂(STAT3激活剂:SD19;MEK抑制剂:AZD6244;P38抑制剂:SB202190和AMPK抑制剂:化合物C)用于检测它们对Linifanib诱导的白色脂肪细胞褐色化的影响。根据实验结果,我们发现,只有STAT3激活剂SD19阻断了Linifanib的作用。该发现与Linifanib对STAT3磷酸化的抑制作用一致。我们已经确定了Linifanib是通过抑制STAT3磷酸化途径来促进白色脂肪细胞褐色化作用的,已有报道显示STAT3能调节脂肪细胞分化,那Linifanib是否会对脂肪的生成产生影响呢?因此我们最后研究了Linifanib对脂肪生成的影响。我们使用3T3-L1细胞系,在分化过程中用Linifanib处理,随后进行油红O染色实验,结果显示,Linifanib能以剂量依赖性方式有效阻止脂肪细胞分化。之后的甘油三酯含量的定量实验也进一步证实了这一结论。随后,我们检测了Linifanib处理后一些脂肪生成相关因子的表达情况,结果显示,Linifanib降低了Pparγ、Cebpα和Ap2的表达。为了进一步研究Linifanib抑制脂肪生成的机制,我们在不同时间点用Linifanib处理3T3-L1脂肪细胞,油红O染色显示,只有在分化的前两天将Linifanib添加到细胞中时,Linifanib才能抑制脂肪细胞分化,Pparγ和Ap2的qPCR分析进一步支持了这一结论。同时我们发现,用Linifanib处理后3T3-L1细胞密度降低,因此,我们假设Linifanib可能影响有丝分裂细胞的扩增。对细胞数量的定量分析证实,Linifanib抑制细胞扩增。综上所述,Linifanib通过抑制STAT3磷酸化而改善细胞代谢,同时促进白色脂肪细胞褐色化和抑制脂肪细胞生成。因此,我们认为,Linifanib可能是治疗肥胖的潜在药物。