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研究背景胃癌是我国常见的恶性肿瘤,其发病率在我国位居第二,死亡率排第三。目前对胃癌的发病机制还未完全阐明。胃癌的发生起源于胃上皮干细胞,是一种干细胞疾病。正常胃上皮干细胞发生基因突变或杂合性缺失形成肿瘤干细胞进而促进肿瘤的发生发展。胃癌组织中存在少量的肿瘤干细胞样细胞,这些细胞具有无限自我更新、多向分化和较强的增殖潜能,正是这些胃癌干细胞促进了胃癌的浸润转移和复发,是胃癌患者预后差的主要原因之一。然迄今对胃癌干细胞参与浸润转移机制有待深入,阐明其浸润转移机制对预警和阻断胃癌细胞浸润和转移具有重要意义。上皮间质化(epithelial mesenchymal transition, EMT)是肿瘤干细胞的重要表型特征之一,EMT即上皮细胞在各种因素的作用下,失去细胞极性,向间质样细胞转化并获得侵袭和迁移能力的过程。EMT是肿瘤重要的恶性生物学行为之一,肿瘤细胞通过EMT浸润和迁移能力增强从而促进转移,在胃癌、结肠癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌等多种肿瘤的原发性浸润和继发性转移中起着重要作用。探讨EMT调控机制对肿瘤细胞的抗转移靶向治疗有着重要的价值。在先前研究中,我们通过构建大肠癌干细胞样细胞cDNA重组逆转录病毒文库等方法,发现了新分子Nrip2,它能促进大肠癌干细胞的自我更新,Rorβ是其关键作用靶蛋白。作为孤儿核受体家族的一员,Rorβ主要表达在中枢神经系统,尤其是调控生理节律的视交叉上核,视网膜和松果体腺,近来随着检测技术灵敏度的增加,发现Rorβ在神经系统外组织如正常骨组织、胰腺和子宫内膜癌及子宫平滑肌肉瘤中也表达。我们通过mRNA FISH和qPCR方法检测发现Rorβ在正常大肠上皮和大肠癌细胞中亦表达；进一步发现Nrip2/Rorβ/HBP1分子间的相互作用通过影响Wnt通路活性而调控大肠癌自我更新。然而Rorβ在胃癌细胞中的作用尚不清楚。实验目的本研究拟在先前研究基础上,探讨Rorβ对胃癌细胞恶性生物学行为的影响,研究Rorβ和Nrip2对胃癌细胞EMT相关转录因子表达的调控作用并检测两者之间的相互作用。实验方法1.检测Rorβ的表达：我们用免疫组化染色和TaqMan(?) Real-time PCR方法分别检测Rorβ在胃癌组织中的表达,并分析其与胃癌分期的相关性。2. Rorβ基因富集分析：200例胃癌组织分成Rorβ高表达组和低表达组,进一步进行基因富集GSEA分析。3.表达Rorβ对Wnt通路的影响：将质粒Rorβ-pReceiver瞬时表达胃癌SGC7901细胞后通过双荧光报告基因和Western Blot方法检测Wnt通路的活性。4.EMT转录因子的检测：将Rorβ-pEGFP-C1、Nrip2-pEGFP-C1和Nrip2T152A重组质粒,分别瞬时转染胃癌SGC7901细胞后,Western Blot检测EMT相关转录因子的表达。5.细胞定位：将Nrip2-pEGFP-C1和Rorβ-pEGFP-C1重组质粒分别瞬时转染胃癌SGC7901细胞,转染24h在共聚焦显微镜下观察及转染48h核浆分离后用Western Blot检测两者在细胞中的定位。6.检测Nrip2和Rorβ蛋白之间的相互作用：将Rorβ-2A-Peptide-Nrip2/pCMV重组质粒瞬时转染胃癌SGC7901细胞,核浆分离后用Western Blot检测Rorβ的表达。实验结果1.Rorβ在胃癌组织中表达下调：经免疫组化染色发现Rorβ蛋白在胃癌组织较正常幽门腺组织表达下调,Real-time PCR亦发现Rorβ mRNA在胃癌组织较癌旁组织表达下调,然其表达与胃癌TNM分期相关性不明显。2. Rorβ促进细胞分化：200例胃癌组织基因富集分析发现Rorβ高表达组较低表达组CD44、ALDH1、ALCAM/CD166等表达下调。3.过表达Rorβ能抑制Wnt通路活性。4. Rorp抑制EMT相关转录因子的表达：慢病毒感染Nrip2的SGC7901细胞显微镜下发现其形态发生改变；过表达Rorβ的细胞Snail/Slug蛋白表达下调,而过表达野生型Nrip2的细胞Snail/Slug、Zeb1蛋白表达上调,然第152位磷酸化位点突变后能消除野生型Nrip2对EMT相关转录因子的上调效应。5.细胞定位：免疫荧光染色和Western Blot检测发现Nrip2主要分布在胞浆,而Rorβ则分布在胞核。6. Nrip2与Rorβ的相互作用：共转染Nrip2和Rorβ后,发现Rorβ被显著“扣留”在胞浆。结论：在胃癌组织中Rorβ表达下调,过表达Rorβ能下调胃癌细胞Wnt通路活性和抑制EMT相关转录因子的表达,Nrip2与Rorβ的相互作用减弱了Rorβ对胃癌细胞EMT相关蛋白表达的抑制效应。