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背景肝内胆管细胞癌(ICC)是肝脏原发性肿瘤中仅次于肝细胞肝癌(HCC)的第二常见的原发性肿瘤。胆管细胞癌是一类致死性胆管上皮性肿瘤,肝内胆管细胞癌在肝实质发生发展。肝内胆管细胞癌多为晚期发现,且预后较差。然而关于肝内胆管细胞癌的研究相对较少,其发生、发展机制尚未阐明。MicroRNAs(miRNA)是一类高度保守的小RNA。它们通过结合于靶基因的3’UTR区域来参与调节细胞的多种生物学行为。越来越多的文献报道,miRNAs在肿瘤的发展过程中发挥着重要的作用,包括增殖、凋亡、侵袭转移、自噬等过程。也有不少文献报道microRNAs参与调控肿瘤细胞的耐药。miR-424-5p目前已在多种肿瘤中被报道参与肿瘤进展,但是其发挥的作用却不尽相同。此外,miR-424-5p在肝内胆管细胞癌中的鲜有报道,而且其对肝内胆管癌的影响也尚不清楚。因此,探索miR-424-5p对肝内胆管细胞癌的作用和机制,可能为肝内胆管细胞癌的治疗研究提供一个不错的策略。目的本研究的研究目的在于探索miR-424-5p在肝内胆管细胞癌患者肿瘤组织及癌旁正常组织中的表达水平,以及其在肝内胆管细胞癌细胞系中的表达水平。我们进一步研究了 miR-424-5p对肝内胆管细胞癌细胞功能的影响,寻找其发挥作用的相关机制以及靶基因,同时研究其靶基因在肝内胆管细胞癌中的作用。方法首先,我们通过实时荧光定量PCR的方法,探究miR-424-5p在肝内胆管细胞癌肿瘤组织和癌旁组织中的表达情况,以及其在正常胆管上皮细胞(HIBEC)和胆管癌细胞系细胞中的表达水平。其次,我们利用miR-424-5p mimics或inhibitors来过表达或抑制miR-424-5p在肝内胆管细胞癌细胞中的表达水平。利用慢病毒载体构建稳定过表达miR-424-5p的肝内胆管癌细胞。接着,我们采用Transwell实验、划痕实验来研究miR-424-5p对肝内胆管癌细胞体外的侵袭转移能力的影响,运用CCK-8实验、EdU实验、集落形成实验等方法研究miR424-5p对肝内胆管癌细胞体外增殖能力的影响。利用小鼠/裸鼠尾静脉肺转移模型研究miR424-5p对肝内胆管癌细胞在生物体内的侵袭转移能力的影响,利用裸鼠皮下成瘤实验研究其对体内增殖能力的影响。随后,我们利用生物信息学数据库网站预测可能的miR-424-5p的靶基因,并且通过双荧光素酶报告实验和蛋白免疫印迹实验验证。然后,我们运用细胞免疫荧光和蛋白免疫印迹的方法,分析miR-424-5p发挥生物学作用的潜在分子机制。最后,采用免疫组织化学染色的方法验证miR-424-5p靶基因在肝内胆管细胞癌中的表达水平,利用TCGA数据库分析其生存预后的关系。结果1.在随机选取的30对肝内胆管细胞癌病例中,我们发现肝内胆管细胞癌肿瘤组织中的miR-424-5p表达量明显低于对应的癌旁组织。相对于永生化的正常胆管上皮细胞HIBEC细胞,在我们拥有的3株胆管癌细胞系中,miR-424-5p的表达量均显著降低。2.在细胞体外功能研究中,我们发现,过表达miR-424-5p可以明显抑制肝内胆管细胞癌细胞的侵袭转移能力,而miR-424-5p几乎不影响肝内胆管癌细胞的增殖能力。3.应用生物信息学数据库网站(miRDB,TargetScan,starBase 2.0)预测出ARK5(NUAK1)是miR-424-5p的靶基因,并且通过双荧光素酶报告实验和蛋白免疫印迹实验证实,miR-424-5p可以与ARK5的3’UTR区结合,并且可以下调ARK5的表达水平。4.在肝内胆管细胞癌细胞中抑制ARK5的表达水平之后,肝内胆管癌细胞的侵袭转移能力显著降低,上皮表型标记物E-Cadherin等明显增加,而间质表型标记物N-Cadherin、Claudin-1等显著减少。5.与miR-424-5p的表达相反,在肝内胆管细胞癌病人样本中,ARK5在肿瘤组织中的表达水平明显高于癌旁正常组织;通过TCGA数据库数据分析,ARK5高表达与较差的生存预后相关。结论1.相较于肝内胆管细胞癌癌旁组织和正常胆管上皮细胞,miR-424-5p在肝内胆管癌组织和肝内胆管癌细胞中的表达水平明显下降。2.miR-424-5p可以抑制肝内胆管细胞癌细胞的侵袭转移能力,抑制肿瘤细胞的上皮-间质转化。3.ARK5被证明是miR-424-5p的靶基因,并且在miR-424-5p引起的转移能力抑制中起到重要作用,并且参与抑制肝内胆管细胞癌细胞转移能力。4.miR-424-5p通过抑制ARK5的表达水平降低mTOR的磷酸化水平,抑制mTOR通路活性,从而降低肝内胆管细胞癌的转移能力。