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microRNAs(miRNAs)是一类18-22nt、内源性的、高度保守的非编码小分子RNA,它们广泛存在于真核生物基因组中。miRNAs在动物睾丸的发育成熟、各种细胞的功能分化以及精子发生过程中发挥着重要的作用。但目前关于miRNAs通过对关键基因的转录后调控来介导精子生成的遗传机制的报道却很有限,有关猪miRNAs基因功能以及与猪繁殖性状相关的miRNAs也鲜有研究。因而,猪睾丸组织miRNAs分离鉴定及功能研究,是一个值得探讨的新课题。本研究主要包括采用miRNAs芯片和实时定量PCR分离鉴定一批猪睾丸组织不同时期差异表达miRNAs、靶基因预测及靶基因表达谱分析、构建miRNAs超表达载体及构建双荧光素酶报告载体,取得如下研究结果:1. miRNAs芯片和实时定量PCR分离鉴定猪睾丸组织中差异表达miRNA选择大白猪60d、180d两个不同发育时期睾丸组织作为研究材料,合成miRNAs芯片(联川生物信息技术有限公司合成),检测到1260条成熟miRNAs序列,而164个探针代表129个miRNAs呈现差异表达(P<0.1),其中在性成熟阶段有51个miRNAs为上调表达,78个为下调表达。对总RNA进行加尾处理,应用qPCR的方法验证9个了差异表达的miRNAs,皮尔森相关系数均为0.5以上。2.靶基因预测及其在不同发育时期睾丸组织中的表达分析我们在NCBI数据库中随机检索得到445条猪基因cDNA序列,并对这445个基因进行了Gene ontology和KEGG通路分析,结果显示:在多组织过程、繁殖过程以及繁殖性状等多种生命过程中起重要的调节作用,并且在17个不同的通路中位于重要的位置。利用RNA22在线软件对上述129个miRNAs序列与445条猪基因cDNA序列分别进行结合位点预测,发现可能存在着15919个结合位点,其中位于基因CDS区域的结合位点占76.95％。对预测与睾丸发育及精子生成相关的7个潜在的靶基因在大白猪35d、60d、90d和180d四个不同时期睾丸组织进行表达分析。分析发现,精子粘附分子(AQN-1)和透明质酸合成酶3(HAS3)随着日龄的增长表达量逐渐增加,到性成熟却急剧下降,精原相关抗原1(SPAG1)的表达模式正好与之相反;精子线粒体相关富含半胱酸蛋白(SMCP)在性成熟后的表达量急剧增加;精子黏附分子(SPAM-1)的表达量随着日龄的增长而增长;DAZL的表达没有特定的规律;环指蛋白4(RNF4)在60d的表达量最高,之后随着日龄的增长其表达量逐渐下降。将生物信息学预测结果与qPCR结果进行比较,发现计算机预测的结果约有一半为假阳性。3. miRNA表达载体和双荧光素酶报告载体的构建扩增miR-762的初始转录本,构建miRNA表达载体,命名为pmiR-762,转染ST细胞,应用qPCR方法进行表达验证,结果表明其可用于miRNA功能的筛选和研究。扩增RNF4基因的3’-UTR,插入到pRL-TK以构建双荧光素酶报告载体,并与pmiR-762共转染ST细胞,应用双荧光素酶检测系统检测双荧光素酶相对活性,结果表明:miR-762与RNF4基因存在着一种负调控关系,并且miR-762对RNF4基因不同基因型的抑制效果具有差异。