Apelin是G蛋白偶联受体家族特异性受体APJ的内源性配体,其编码序列定位在染色体Xq25-q26.1上。Apelin和APJ广泛分布于血管壁细胞、内皮细胞和心肌细胞中,多种复杂因素均可调控Apelin基因表达和分泌,提示其在心血管系统生理或病理生理进程中发挥重要调控作用。课题组前期研究成果揭示,Apelin-13/APJ系统可通过铁自噬-SFXN1依赖性线粒体铁超载途径、Caveolin-1-自噬途径、PI3K/AKT/ERK1/2/p70S6K-自噬途径、内质网应激-自噬途径、线粒体丝氨酸/一碳单位途径、GOLPH3-高尔基体自噬途径等促进心肌细胞肥大发生发展,但确切机制仍有待进一步探究。自噬是普遍存在于机体组织、细胞中的一种较为保守的降解代谢过程,自噬过度激活加剧心脏压力超负荷、导致心肌收缩功能障碍,促进心力衰竭所致的心肌病理性重构。一项涉及多细胞系单一细胞器功能学的研究证实,选择性自噬参与高尔基体的质量控制和形态稳定,并促进高尔基体进入自噬流发生降解,并被命名为高尔基体自噬（Golgiphagy）。课题组研究结果揭示,Apelin-13/APJ系统上调高尔基体应激标志蛋白GOLPH3,诱导高尔基体应激,破坏高尔基体形态结构,高尔基体膜囊与自噬相关蛋白LC3结合并进入自噬流,诱导Golgiphagy发生发展,然而其中所涉及的具体机制尚未阐明。GOLPH3介导高尔基体自噬能否参与Apelin-13/APJ系统促心肌肥厚仍需进一步探明。类泛素化修饰作为蛋白质翻译后修饰方式之一,在心肌肥厚发生发展中起着关键调控作用。类泛素样分子SUMO与靶蛋白氨基酸序列中的赖氨酸残基相互结合,激活或抑制靶蛋白生物学功能、改变其空间定位、促进其溶酶体降解等,在自噬过程中发挥重要激活和调控作用。然而,类泛素化修饰是否参与高尔基体应激,何种SUMO分子参与调控GOLPH3介导高尔基体自噬仍不明确,且Apelin-13/APJ系统在类泛素化修饰中的具体作用仍需进一步探究。据此,我们提出“SENP7去类泛素化修饰AQP4诱导高尔基体自噬介导Apelin-13/APJ系统促心肌细胞肥大”这一科学假说。即Apelin-13/APJ系统抑制SENP7去类泛素化修饰,促进SUMO2类泛素化修饰高尔基体膜蛋白AQP4,介导高尔基体超氧阴离子O2-病理性蓄积,诱导高尔基体自噬,最终加剧心肌肥厚发生发展。为验证这一假说,研究内容分为七个部分进行:（1）GOLPH3介导Apelin-13/APJ系统促H9C2大鼠心肌细胞高尔基体自噬发生;（2）Apelin-13/APJ系统上调高尔基体膜蛋白AQP4促H9C2大鼠心肌细胞高尔基体自噬发生;（3）SUMO2类泛素化修饰高尔基体膜蛋白AQP4参与Apelin-13/APJ系统促GOLPH3介导H9C2大鼠心肌细胞高尔基体自噬发生;（4）去类泛素化酶SENP7参与Apelin-13/APJ系统促GOLPH3介导H9C2大鼠心肌细胞高尔基体自噬;（5）Apelin-13/APJ系统诱导高尔基体选择性进入自噬流促GOLPH3介导H9C2大鼠心肌细胞高尔基体自噬;（6）GOLPH3介导高尔基体自噬参与Apelin-13/APJ系统促H9C2大鼠心肌细胞肥大;（7）GOLPH3调控高尔基体自噬参与Ang Ⅱ诱导大鼠心肌肥厚发生发展。本项目将阐明抑制SENP7去类泛素化修饰,促进SUMO2靶向高尔基体,类泛素化修饰高尔基体膜蛋白AQP4,促进高尔基体超氧阴离子O2-病理性蓄积,破坏高尔基体结构,加剧高尔基体应激,诱导GOLPH3介导高尔基体自噬参与Apelin-13/APJ系统促心肌肥厚发生发展的新分子机理。拓展Apelin-13/APJ系统调控AQP4类泛素化修饰、GOLPH3介导高尔基体自噬的新生物学功能,明确Apelin-13/APJ系统参与心肌肥厚进展的具体机制,以期为Apelin-13/APJ系统成为心肌肥厚治疗新靶点提供新的理论依据和实验基础。第一部分GOLPH3介导Apelin-13/APJ系统促H9C2大鼠心肌细胞高尔基体自噬发生目的:观察Apelin-13/APJ对高尔基体GOLPH3蛋白表达的影响,探究Apelin-13/APJ系统促进高尔基体解构象、破坏高尔基体形态,诱导高尔基体自噬发生发展。方法:Apelin-13以不同浓度梯度和不同时间梯度孵育H9C2大鼠心肌细胞;加入APJ受体拮抗剂F13A或自噬抑制剂3-MA处理H9C2大鼠心肌细胞后,再次加入Apelin-13;pcDNA3.1质粒载体过表达GOLPH3或同时加入自噬激活剂雷帕霉素及3-MA,Western Blot观察LC3、p62、TFE3、SPCA1、GOLPH3蛋白水平。免疫共沉淀实验,分析H9C2大鼠心肌细胞内LC3与GOLPH3相互作用关系。细胞免疫荧光分别标记LC3、高尔基体顺式膜囊标志物GM130及反式膜囊标志物TGN46,观察LC3与GM130和TGN46共定位情况。pcDNA3.1质粒载体过表达GOLPH3,透射电镜观察H9C2大鼠心肌细胞内高尔基体形态结构改变、高尔基体与自噬囊泡融合情况、胞内自噬小体形成数量。结果:Apelin-13呈浓度和时间依赖性上调H9C2大鼠心肌细胞中LC3、TFE3、SPCA1以及GOLPH3蛋白水平,下调p62蛋白水平;F13A及3-MA抑制Apelin-13促H9C2大鼠心肌细胞LC3、TFE3、SPCA1以及GOLPH3蛋白水平上调和p62蛋白水平下调;免疫共沉淀结果显示,Apelin-13呈浓度和时间依赖性促进GOLPH3与LC3相互作用,而F13A及3-MA抑制Apelin-13促LC3与GOLPH3相互作用;GOLPH3过表达上调LC3、TFE3、SPCA1蛋白水平,下调p62蛋白水平。3-MA显著抑制GOLPH3过表达促LC3、TFE3、SPCA1蛋白水平上调和p62下调;免疫荧光显示,GOLPH3过表达促LC3与高尔基体顺式膜囊标志GM130及反式膜囊标志物TGN46共定位;透射电镜显示,GOLPH3过表达促进H9C2大鼠心肌细胞内自噬囊泡增多,高尔基体结构破坏明显、空泡化严重,且高尔基体碎片与胞内囊泡融合,进入自噬流。小结:（1）Apelin-13/APJ系统加剧高尔基体应激,促进GOLPH3与LC3相互结合,诱导H9C2大鼠心肌细胞高尔基体自噬发生;（2）GOLPH3介导Apelin-13/APJ系统促H9C2大鼠心肌细胞高尔基体自噬发生发展。第二部分Apelin-13/APJ系统上调高尔基体膜蛋白AQP4促H9C2大鼠心肌细胞高尔基体自噬发生目的:观察Apelin-13/APJ对H9C2大鼠心肌细胞高尔基体膜蛋白AQP4表达的影响,探究AQP4参与高尔基体应激及LC3和GOLPH3相互结合的具体作用,明确高尔基体膜蛋白AQP4介导高尔基体超氧阴离子O2-病理性蓄积在高尔基体形态结构破坏,高尔基体自噬中具体作用和机制。方法:构建并转染AQP4干扰链,Apelin-13以不同浓度梯度和不同时间梯度孵育H9C2大鼠心肌细胞;F13A或3-MA处理H9C2大鼠心肌细胞后,再次加入Apelin-13;pcDNA3.1质粒载体过表达GOLPH3或同时加入雷帕霉素及3-MA,Western Blot观察AQP4、LC3、p62、TFE3、SPCA1、GOLPH3蛋白水平。透射电镜观察AQP4敲除对GOLPH3过表达促高尔基体自噬的影响。免疫荧光检测,AQP4敲除后LC3与高尔基体顺式膜囊标志物GM130及反式膜囊标志物TGN46共定位情况。免疫共沉淀实验检测,AQP4敲除对LC3与GOLPH3相互作用的影响。高尔基体绿色荧光探针GolgiGreen标记高尔基体膜囊组分PtdIns（4）P,观察Apelin-13或GOLPH3过表达对高尔基体形态、结构、质量的影响。进一步游离H9C2大鼠心肌细胞高尔基体,Western Blot检测Apelin-13或GOLPH3过表达对高尔基体上AQP4、LC3、p62、TFE3、SPCA1、GOLPH3蛋白水平的影响。免疫共沉淀技术检测,Apelin-13对高尔基体上LC3与GOLPH3相互作用的影响。过表达GOLPH3或同时加入布雷非德菌素A（BrefeldinA,BFA）,免疫荧光检测LC3与GM130或TGN46共定位情况。CellROX超氧阴离子检测试剂盒Green Reagent孵育H9C2大鼠心肌细胞,荧光流式细胞分选仪分析胞内O2-含量。结果:Apelin-13呈浓度和时间依赖性上调AQP4蛋白水平,F13A及3-MA 抑制 Apelin-13 促 AQP4 蛋白水平上调;si-AQP4 抑制 Apelin-13或GOLPH3过表达促LC3、TFE3、SPCA1及GOLPH3上调及p62下调;透射电镜显示si-AQP4抑制GOLPH3过表达促H9C2大鼠心肌细胞内自噬囊泡增多,部分恢复高尔基体形态结构、空泡化显著减少,且高尔基体碎片与胞内囊泡融合程度降低;免疫共沉淀显示,si-AQP4抑制Apelin-13促H9C2大鼠心肌细胞LC3与GOLPH3相互作用;si-AQP4抑制Apelin-13促进LC3与GM130或TGN46共定位;GolgiGreen标记高尔基体膜囊组分PtdIns（4）P,发现si-AQP4上调高尔基体荧光强度,部分升高高尔基体质量,恢复破碎高尔基体形态结构;Apelin-13（1μM）、F13A（1μM,30min）或 3-MA（5mM,4h）处理 H9C2 大鼠心肌细胞并游离高尔基体,Western Blot检测Apelin-13上调高尔基体上LC3、AQP4蛋白水平,下调p62蛋白水平;免疫共沉淀实验显示,si-AQP4抑制Apelin-13促高尔基体上LC3与GOLPH3相互作用;免疫荧光结果显示,加入BFA后,si-AQP4抑制GOLPH3过表达促LC3与GM130或TGN46共定位;此外,si-AQP4上调高尔基体荧光强度,部分升高高尔基体质量,恢复GOLPH3过表达导致的高尔基体形态结构破碎;CellROX超氧阴离子检测试剂盒Green Reagent孵育H9C2大鼠心肌细胞,荧光流式细胞分选仪进行结果分析,Apelin-13促进H9C2大鼠心肌细胞内O2-含量升高,而F13A或3-MA抑制Apelin-13的作用;si-AQP4显著抑制Apelin-13或GOLPH3过表达促胞内O2-含量升高。小结:（1）Apelin-13/APJ系统上调高尔基体膜蛋白AQP4蛋白水平,加剧高尔基体应激,促进GOLPH3与LC3相互结合,诱导H9C2大鼠心肌细胞高尔基体自噬发生;（2）高尔基体膜蛋白AQP4促进高尔基体超氧阴离子O2-病理性蓄积参与Apelin-13/APJ系统促GOLPH3介导H9C2大鼠心肌细胞高尔基体自噬发生发展。第三部分 SUMO2类泛素化修饰高尔基体膜蛋白AQP4参与Apelin-13/APJ系统促GOLPH3介导H9C2大鼠心肌细胞高尔基体自噬发生目的:观察Apelin-13/APJ系统对高尔基体SUMO2表达及类泛素化修饰的影响,探究SUMO2能否促进高尔基体膜蛋白AQP4类泛素化修饰,明确SUMO2类泛素化修饰AQP4具体位点,阐明高尔基体膜蛋白AQP4促超氧阴离子O2-病理性蓄积参与Apelin-13促GOLPH3介导高尔基体自噬具体机制。方法:银杏酸孵育H9C2大鼠心肌细胞,过表达GOLPH3或加入Apelin-13,Western Blot 观察 LC3、p62、TFE3、SPCA1 及 GOLPH3蛋白表达变化。免疫共沉淀检测H9C2大鼠心肌细胞GOLPH3与LC3相互作用情况。免疫荧光观察银杏酸对LC3与高尔基体顺式膜囊标志物GM130或反式膜囊标志物TGN46共定位的影响。Apelin-13以不同浓度梯度和不同时间梯度,或Apelin-13同时加入F13A或3-MA,或3-MA同时GOLPH3过表达孵育H9C2大鼠心肌细胞。Western Blot检测Apelin-13对H9C2大鼠心肌细胞SUMO1、SUMO2及SUMO3蛋白水平影响。游离高尔基体,Western Blot检测Apelin-13或GOLPH3过表达对高尔基体SUMO1、SUMO2及SUMO3蛋白水平的影响。利用抗原-抗体反应标记H9C2大鼠心肌细胞内SUMO2蛋白,免疫胶体金电镜检测Apelin-13或GOLPH3过表达对H9C2大鼠心肌细胞内SUMO2蛋白水平,以及SUMO2在高尔基体或自噬小体内富集情况。构建并转染SUMO2干扰链,Western Blot观察H9C2大鼠心肌细胞内LC3、p62、TFE3、SPCA1、GOLPH3蛋白水平的影响。透射电镜观察SUMO2干扰链对Apelin-13或GOLPH3过表达促高尔基体自噬的影响。免疫共沉淀进一步检测SUMO2干扰链对Apelin-13促GOLPH3与LC3相互作用的影响。敲除H9C2大鼠心肌细胞SUMO2并游离高尔基体,免疫共沉淀探究高尔基体上LC3与GOLPH3相互作用情况。免疫荧光实验观察SUMO2敲除对Apelin-13或GOLPH3过表达促LC3与高尔基体膜囊标志物GM130或TGN46共定位的影响。Apelin-13或GOLPH3过表达处理H9C2大鼠心肌细胞,免疫共沉淀实验检测AQP4与SUMO2之间相互作用关系。同样处理条件下,进一步游离高尔基体,免疫共沉淀实验检测高尔基体上AQP4与SUMO2相互作用关系。构建并转染SUMO2增强型绿色荧光表达质粒EGFP-SUMO2、AQP4红色荧光表达质粒RFP-AQP4,激光共聚焦技术检测SUMO2与AQP4空间定位关系。免疫沉淀技术SUMO2结合并Pull down高尔基体AQP4,常规电泳并送质谱检测,探明SUMO2结合AQP4具体位点。根据该位点构建并转染AQP4野生型质粒或AQP4点突变质粒,Western Blot检测AQP4点突变对H9C2大鼠心肌细胞LC3、p62、TFE3、SPCA1、GOLPH3蛋白水平的影响。免疫共沉淀实验检测AQP4点突变能否影响Apelin-13或GOLPH3过表达促AQP4与SUMO2相互作用。此外,AQP4干扰链敲除H9C2大鼠心肌细胞内源性AQP4表达并游离高尔基体,免疫共沉淀技术检测AQP4点突变对Apelin-13或GOLPH3过表达促高尔基体AQP4与SUMO2相互作用关系的影响。免疫共沉淀技术检测AQP4点突变是否影响Apelin-13促高尔基体上LC3与GOLPH3相互作用关系。免疫荧光观察AQP4点突变对Apelin-13或GOLPH3过表达促LC3与高尔基体膜囊标志物GM130或TGN46共定位的影响。CellROX超氧阴离子检测试剂盒Green Reagent孵育H9C2大鼠心肌细胞,荧光流式细胞分选仪分别检测SUMO2干扰链对H9C2大鼠心肌细胞内O2-水平的影响,以及AQP4点突变对Apelin-13或GOLPH3过表达促H9C2大鼠心肌细胞内O2-水平升高的影响。结果:银杏酸抑制Apelin-13或GOLPH3过表达或雷帕霉素促LC3、TFE3、SPCA1、GOLPH3蛋白水平上调和p62下调;银杏酸抑制Apelin-13促H9C2大鼠心肌细胞LC3与GOLPH3相互作用;银杏酸抑制Apelin-13或GOLPH3过表达促LC3与GM130、TGN46共定位;Apelin-13呈浓度和时间依赖性上调H9C2大鼠心肌细胞中SUMO1、SUMO2、SUMO3 蛋白水平,F13A 或 3-MA 抑制 Apelin-13 作用。GOLPH3过表达上调H9C2大鼠心肌细胞SUMO1、SUMO2、SUMO3蛋白水平,3-MA抑制GOLPH3过表达作用。游离高尔基体,Apelin-13呈浓度和时间依赖性上调高尔基体中SUMO2、SUMO3蛋白水平,但不影响SUMO1;GOLPH3过表达上调高尔基体中SUMO2蛋白水平,但不影响SUMO1及SUMO3;免疫电镜标记H9C2大鼠心肌细胞内SUMO2,发现Apelin-13或GOLPH3过表达上调SUMO2蛋白水平,促进高尔基体结构松散、空泡化严重,高尔基体碎片与自噬囊泡融合明显,且SUMO2明显富集于高尔基体膜上;敲除SUMO2抑制Apelin-13促LC3、TFE3、SPCA1、GOLPH3蛋白上调和p62下调;敲除SUMO2抑制GOLPH3过表达促LC3、TFE3、SPCA1蛋白上调和p62下调;敲除SUMO2抑制Apelin-13或GOLPH3过表达促H9C2大鼠心肌细胞内自噬囊泡增多,部分恢复高尔基体形态结构、空泡化显著减少,且高尔基体碎片与胞内囊泡融合程度降低。SUMO2敲除抑制Apelin-13促LC3与GOLPH3相互作用;进一步游离高尔基体并敲除SUMO2,抑制Apelin-13促高尔基体上LC3与GOLPH3相互作用;敲除SUMO2抑制Apelin-13或GOLPH3过表达促LC3与高尔基体膜囊标志物GM130或TGN46共定位;Apelin-13或GOLPH3促H9C2大鼠心肌细胞SUMO2与AQP4相互作用;游离高尔基体,Apelin-13或GOLPH3促高尔基体上SUMO2与AQP4相互作用;Apelin-13或GOLPH3过表达促SUMO2和AQP4空间定位率均超过50%,且集中于高尔基体附近;免疫沉淀SUMO2 Pull down高尔基体AQP4,切胶后质谱检测SUMO2通过AQP4第311位赖氨酸促进其类泛素化修饰。构建并转染AQP4野生型（AQP4WT）或 AQP4 点突变型（AQP4K311R）质粒发现,AQP4K311R抑制 Apelin-13 或 GOLPH3 过表达促 LC3、TFE3、SPCA1、GOLPH3 蛋白水平升高。AQP4K311R几乎完全阻断Apelin-13或GOLPH3过表达促H9C2大鼠心肌细胞AQP4和SUMO2相互作用;游离高尔基体,AQP4K311R抑制Apelin-13或GOLPH3过表达促高尔基体上AQP4和SUMO2相互作用;AQP4干扰链敲除H9C2大鼠心肌细胞内源性AQP4表达并游离高尔基体,AQP4K311R抑制Apelin-13促高尔基体上LC3和GOLPH3 相互作用;AQP4K311R抑制Apelin-13 或 GOLPH3 过表达促高尔基体LC3与GM130及TGN46共定位;CellROX超氧阴离子检测试剂盒Green Reagent孵育H9C2大鼠心肌细胞,荧光流式细胞分选仪检测发现SUMO2敲除抑制Apelin-13或GOLPH3过表达促H9C2大鼠心肌细胞O2-含量升高;AQP4K311R抑制Apelin-13或GOLPH3过表达促H9C2大鼠心肌细胞O2-含量升高小结:（1）Apelin-13/APJ系统上调并靶向SUMO2高尔基体富集;（2）Apelin-13/APJ系统促进高尔基体SUMO2通过第311位赖氨酸基团类泛素化修饰高尔基体膜蛋白AQP4;（3）高尔基体SUMO2类泛素化修饰高尔基体膜蛋白AQP4促进高尔基体超氧阴离子O2-病理性蓄积参与Apelin-13/APJ系统促GOLPH3介导高尔基体自噬。第四部分去类泛素化酶SENP7参与Apelin-13/APJ系统促GOLPH3介导H9C2大鼠心肌细胞高尔基体自噬目的:观察Apelin-13/APJ系统对去类泛素化修饰酶SENP7蛋白水平的影响,探明SENP7去类泛素化修饰对SUMO2类泛素化修饰高尔基体膜蛋白AQP4的具体作用,阐明SENP7去类泛素化修饰参与GOLPH3介导高尔基体自噬的具体分子机制。方法:Apelin-13以不同浓度梯度和不同时间梯度、F13A或3-MA孵育H9C2大鼠心肌细胞,Western Blot检测SENP7蛋白水平。构建并转染SENP7干扰链,Western Blot检测高尔基体SUMO2表达水平。构建并转染SENP7慢病毒表达质粒pLenti-SENP7并游离高尔基体,免疫共沉淀检测AQP4与SUMO2相互作用关系。转染pLenti-SENP7并同时Apelin-13 或 GOLPH3 过表达处理,Western Blot 检测 LC3、p62、TFE3、SPCA1、GOLPH3蛋白水平变化。pLenti-SENP7转染H9C2大鼠心肌细胞过表达SENP7,或同时孵育Apelin-13后透射电镜观察高尔基体形态及自噬的形态学改变。游离高尔基体,免疫共沉淀检测高尔基体上LC3与GOLPH3共定位情况。免疫荧光观察SENP7慢病毒表达质粒pLenti-SENP7对LC3与高尔基体膜囊标志蛋白GM130或TGN46共定位的影响。转染pLenti-SENP7或同时Apelin-13、GOLPH3过表达处理H9C2大鼠心肌细胞。CellROX超氧阴离子检测试剂盒行荧光流式分析胞内O2-蓄积情况。结果:Apelin-13呈时间和浓度依赖性下调H9C2大鼠心肌细胞SENP7蛋白水平,F13A或3-MA抑制Apelin-13作用;SENP7敲除上调高尔基体SUMO2蛋白水平,促进类泛素化修饰作用;构建慢病毒质粒pLenti-SENP7转染H9C2大鼠心肌细胞,过表达SENP7抑制Apelin-13或GOLPH3过表达促高尔基体SUMO2与AQP4相互作用;SENP7过表达抑制 Apelin-13 或 GOLPH3 过表达促 LC3、TFE3、SPCA1、GOLPH3蛋白水平上调和p62下调;SENP7过表达抑制Apelin-13或GOLPH3过表达促H9C2大鼠心肌细胞自噬囊泡数量增多,高尔基体结构破坏、空泡化加剧,降低高尔基体碎片与胞内囊泡融合程度;SENP7过表达抑制Apelin-13促高尔基体LC3与GOLPH3相互作用;SENP7过表达抑制Apelin-13促LC3与高尔基体膜囊标志蛋白GM130或TGN46共定位;SENP7过表达抑制Apelin-13或GOLPH3过表达促H9C2大鼠心肌细胞O2-含量升高。小结:（1）Apelin-13/APJ系统抑制SENP7介导的H9C2大鼠心肌细胞去类泛素化修饰;（2）SENP7去类泛素化修饰参与SUMO2类泛素化修饰高尔基体膜蛋白AQP4,促进高尔基体超氧阴离子O2-病理性蓄积;（3）Apelin-13/APJ系统抑制SENP7去类泛素化修饰,促进GOLPH3介导H9C2大鼠心肌细胞高尔基体自噬。第五部分Apelin-13/APJ系统诱导高尔基体选择性进入自噬流促GOLPH3介导H9C2大鼠心肌细胞高尔基体自噬目的:研究Apelin-13/APJ系统对自噬相关蛋白ATG5、ATG8、ATG12蛋白水平的影响,观察Apelin-13/APJ系统能否促进自噬囊泡包裹高尔基体形成自噬小体,阐明Apelin-13/APJ系统通过VPS35介导自噬小体的内体循环机制,明确Apelin-13/APJ系统在自噬小体的延伸及成熟中的具体作用,拓展以溶酶体蛋白LAMP2A介导的高尔基体为底物的选择性自噬降解在Apelin-13/APJ系统促高尔基体自噬中的新生物学功能。方法:Apelin-13以不同浓度梯度、不同时间梯度、F13A、3-MA或银杏酸处理H9C2大鼠心肌细胞,Western Blot检测ATG5、ATG8、ATG12蛋白水平。Apelin-13或同时转染SUMO2干扰链、AQP4干扰链、AQP4点突变质粒及SENP7慢病毒质粒处理H9C2大鼠心肌细胞,饱和甲硝唑等密度差速离心法提取自噬小体,Western Blot检测分别检测自噬小体或细胞总蛋白中 GOLPH3、AQP4、SUMO2、ATG5、ATG12、GM130、TGN46蛋白水平。转染SUMO2干扰链、AQP4点突变质粒以及SENP7慢病毒质粒,并同时加入Apelin-13孵育H9C2大鼠心肌细胞,免疫沉淀实验检测GOLPH3与ATG5或ATG12结合情况。Apelin-13处理H9C2大鼠心肌细胞,绿色或红色荧光分别标记早期内体标志蛋白EEA1、晚期内体标志蛋白LAMP2A、循环内体标志蛋白RAB11,自噬囊泡形成标志蛋白ATG5、ATG8以及ATG12,成熟自噬小体标志蛋白STX17,同时红色或绿色荧光标记GOLPH3,免疫荧光观察高尔基体在内体循环中的共定位情况。Apelin-13或GOLPH3过表达处理H9C2大鼠心肌细胞,免疫共沉淀实验检测VPS35与高尔基体膜囊标志物Giantin、GM130或TGN46相互作用情况。进一步免疫荧光观察VPS35与Giantin胞内共定位情况。Apelin-13或GOLPH3过表达处理H9C2大鼠心肌细胞,免疫共沉淀实验检测LAMP2A与高尔基体膜囊标志物Giantin、GM130或TGN46相互作用情况。进一步免疫荧光观察LAMP2A与Giantin胞内共定位情况。结果:Apelin-13呈时间和浓度依赖性上调自噬相关蛋白ATG5、ATG12蛋白水平,但不影响ATG8;F13A、3-MA或GA均抑制Apelin-13促ATG5 及 ATG12 蛋白上调;Apelin-13 上调 GOLPH3、AQP4、SUMO2、ATG5、ATG12蛋白水平,下调GM130及TGN46蛋白水平,敲除SUMO2、AQP4点突变、SENP7过表达均抑制Apelin-13的作用;Apelin-13上调自噬小体内 GOLPH3、AQP4、SUMO2、ATG5、ATG12、GM130 及TGN46蛋白水平,敲除SUMO2、AQP4点突变、SENP7过表达均抑制Apelin-13的作用;免疫共沉淀实验发现Apelin-13促GOLPH3与ATG5及 ATG12 结合,而si-SUMO2、AQP4K311R和SENP7 过表达抑制 Apelin-13作用;免疫荧光显示,GOLPH3分别与EEA1、LAMP2A、RAB11、ATG5、ATG12、STX17共定位,但与ATG8无明显定位关系;Apelin-13或GOLPH3过表达促进VPS35与高尔基体膜囊标志物GM130、TGN46及Giantin相互作用;Apelin-13或GOLPH3过表达促进VPS35与Giantin共定位;Apelin-13或GOLPH3过表达促进LAMP2A与高尔基体膜囊标志物 GM130、TGN46 及 Giantin 相互作用;Apelin-13 或 GOLPH3 过表达促进LAMP2A与Giantin共定位。小结:（1）Apelin-13/APJ系统上调H9C2大鼠心肌细胞ATG5、ATG12蛋白水平;（2）Apelin-13/APJ系统通过ATG5-ATG12复合物促进高尔基体与自噬囊泡融合;（3）Apelin-13/APJ系统通过VPS35促高尔基体-自噬囊泡进入内体循环,形成成熟自噬小体;（4）Apelin-13/APJ系统通过LAMP2A促进高尔基体进入溶酶体发生降解。第六部分GOLPH3介导高尔基体自噬参与Apelin-13/APJ系统促H9C2大鼠心肌细胞肥大目的:明确Apelin-13/APJ系统能否通过抑制SENP7去类泛素化修饰促进心肌细胞肥大,探究SUMO2类泛素化修饰高尔基体膜蛋白AQP4在心肌肥大过程中的具体作用,阐明GOLPH3介导高尔基体自噬促进心肌细胞肥大发生发展的具体机制。方法:Apelin-13以不同浓度梯度、不同时间梯度、F13A、3-MA处理H9C2大鼠心肌细胞,Western Blot检测ANP、BNP及β-MHC蛋白水平,荧光显微镜2.5D分析及手持式细胞计数仪检测H9C2大鼠心肌细胞体积、细胞直径。GOLPH3过表达或3-MA处理H9C2大鼠心肌细胞,Western Blot检测ANP、BNP及β-MHC蛋白水平,荧光显微镜2.5D分析及手持式细胞计数仪检测H9C2大鼠心肌细胞体积、细胞直径。AQP4干扰链转染H9C2大鼠心肌细胞或同时孵育Apelin-13或GOLPH3过表达,Western Blot检测ANP、BNP及β-MHC蛋白水平,荧光显微镜2.5D分析及手持式细胞计数仪检测H9C2大鼠心肌细胞体积、细胞直径。银杏酸、Apelin-13、雷帕霉素、AQP4点突变、SUMO2干扰链、AQP4干扰链或GOLPH3过表达处理H9C2大鼠心肌细胞,Western Blot检测ANP、BNP及β-MHC蛋白水平,手持式细胞计数仪检测H9C2大鼠心肌细胞体积、细胞直径。转染SENP7慢病毒质粒pLenti-SENP7,或同时Apelin-13或GOLPH3过表达处理H9C2大鼠心肌细胞,Western Blot检测ANP、BNP及β-MHC蛋白水平,手持式细胞计数仪检测H9C2大鼠心肌细胞体积、细胞直径。结果:Apelin-13呈时间和浓度依赖性上调H9C2大鼠心肌细胞ANP、BNP及β-MHC蛋白水平;F13A或3-MA抑制Apelin-13促H9C2大鼠心肌细胞ANP、BNP及β-MHC蛋白水平上调;Apelin-13促H9C2大鼠心肌细胞体积增大,F13A或3-MA抑制Apelin-13作用;Apelin-13促H92大鼠心肌细胞直径增长,体积变大,F13A或3-MA抑制Apelin-13作用;GOLPH3过表达上调ANP、BNP及β-MHC蛋白水平,促进H9C2大鼠心肌细胞体积增大、直径增长,3-MA抑制GOLPH3过表达作用;AQP4 敲除抑制 Apelin-13 或 GOLPH3 过表达促 ANP、BNP 和β-MHC蛋白水平上调、心肌细胞体积增大、直径增长;银杏酸抑制Apelin-13或GOLPH3过表达促ANP、BNP和β-MHC蛋白水平上调;SUMO2敲除抑制Apelin-13或GOLPH3过表达促ANP、BNP和β-MHC蛋白水平上调、心肌细胞体积增大、直径增长;AQP4点突变抑制Apelin-13或GOLPH3过表达促ANP、BNP和β-MHC蛋白水平上调、心肌细胞体积增大、直径增长;SENP7过表达抑制Apelin-13或GOLPH3过表达促ANP、BNP和β-MHC蛋白水平上调、心肌细胞体积增大、直径增长。小结:（1）GOLPH3介导高尔基体自噬参与Apelin-13/APJ系统促H9C2大鼠心肌细胞肥大;（2）SENP7去类泛素化修饰介导SUMO2类泛素化修饰高尔基体膜蛋白AQP4促GOLPH3介导高尔基体自噬参与Apelin-13/APJ系统促进H9C2大鼠心肌细胞肥大。第七部分GOLPH3调控高尔基体自噬参与Ang Ⅱ诱导大鼠心肌肥厚发生发展目的:明确高尔基体自噬在Ang Ⅱ诱导心肌肥厚中的具体作用,阐明GOLPH3介导高尔基体自噬能否促进心肌肥厚发生发展。方法:26只,6周龄,雄性,体重均200g的Sprague Dawley大鼠（实验过程死亡1只）分为3组:PBS组、Ang Ⅱ组及Ang Ⅱ+AAV9-shGolph3组。构建大鼠心脏靶向特异性GOLPH3敲除腺相关病毒AAV9-shGolph3。尾静脉分别注射等体积PBS溶液或AAV9-shGolph3溶液,待注射14天腺相关病毒达表达高峰后,大鼠皮下植入搭载PBS或预配置Ang Ⅱ溶液的ALZET微渗透泵,植入第42天后取出ALZET微渗透泵,计算大鼠体重及ALZET微渗透泵重量,缝合伤口。待第60天时,处死取材。在饲养大鼠的60天内,每组每只大鼠每5天进行一次体重测量并记录。心脏灌注PBS及多聚甲醛,取材后测量心脏重量、大鼠体重以及胫骨长度。心脏进行组织切片及HE染色,观察心脏心腔扩张、心壁厚度,心肌细胞形态结构、排列顺序及体积变化。免疫组化检测心脏组织切片中LC3、GOLPH3、SUMO2、AQP4及SENP7阳性表达情况。提取心脏组织蛋白,Western Blot检测心脏组织中LC3、p62、GOLPH3、AQP4、SUMO2、SENP7、GM130、TGN46、TFE3、SPCA1、ANP、BNP和β-MHC蛋白水平。结论:1.Apelin-13/APJ系统通过GOLPH3诱导H9C2大鼠心肌细胞高尔基体自噬发生;2.Apelin-13/APJ系统上调高尔基体膜蛋白AQP4蛋白水平,促进高尔基体超氧阴离子O2-病理性蓄积,加剧GOLPH3介导H9C2大鼠心肌细胞高尔基体自噬发生发展;3.Apelin-13/APJ系统促SUMO2靶向高尔基体富集,通过第311位赖氨酸基团类泛素化修饰高尔基体膜蛋白AQP4促GOLPH3介导H9C2大鼠心肌细胞高尔基体自噬发生发展;4.Apelin-13/APJ系统抑制SENP7去类泛素化修饰,促进SUMO2类泛素化修饰高尔基体膜蛋白AQP4,参与GOLPH3介导H9C2大鼠心肌细胞高尔基体自噬;5.Apelin-13/APJ系统通过ATG5-ATG12复合物促进高尔基体与自噬囊泡融合,通过VPS35促进高尔基体-自噬囊泡延伸,形成成熟自噬小体,通过LAMP2A促进高尔基体进入溶酶体发生降解;6.SENP7去类泛素化修饰介导SUMO2类泛素化修饰高尔基体膜蛋白AQP4促GOLPH3介导高尔基体自噬参与Apelin-13/APJ系统促进H9C2大鼠心肌细胞肥大;7.GOLPH3介导高尔基体自噬参与Ang Ⅱ促大鼠心肌肥厚;8.SENP7/SUMO2/AQP4信号通路调控GOLPH3介导高尔基体自噬参与Ang Ⅱ促大鼠心肌肥厚。结果:PBS、Ang Ⅱ及Ang Ⅱ+GOLPH3敲除组大鼠体重均随饲养天数呈递增趋势,但组间大鼠体重无明显差异;Ang Ⅱ促进大鼠心脏体重比、心脏胫骨比增加,GOLPH3敲除抑制Ang Ⅱ作用;Ang Ⅱ促进大鼠心脏心腔变小、心壁增厚、心肌细胞明显膨胀肥大,GOLPH3敲除抑制AngⅡ 的作用;AngⅡ 促进LC3、GOLPH3、SUMO2、AQP4 阳性表达,SENP7则明显下调,GOLPH3敲除结果则相反;Ang Ⅱ上调大鼠心脏组织 LC3、SUMO2、AQP4、TFE3、SPCA1、GOLPH3、GM130、TGN46、ANP、BNP和β-MHC蛋白水平,下调p62及SENP7,GOLPH3敲除结果则相反。小结:（1）Ang Ⅱ促大鼠心肌肥厚破坏心肌细胞高尔基体形态结构;（2）GOLPH3参与Ang Ⅱ促大鼠心肌肥厚;（3）GOLPH3介导高尔基体自噬可能参与Ang Ⅱ促大鼠心肌肥厚;（4）SENP7/SUMO2/AQP4信号通路参与Ang Ⅱ促大鼠心肌肥厚。