背景心肌梗死后心室重构(Ventricular remodeling,VR)是指急性心肌梗死(Acute myocardial infarction,AMI)后心脏在受到损伤或超负荷状态下,引起血流动力学的改变和神经体液调节机制激活,出现复杂的分子信号改变和胚胎基因及蛋白再表达,从而造成心肌细胞适应不良性肥大、心肌细胞凋亡和心肌细胞外基质纤维化,临床上主要表现为心室肌肥厚,心室容量的增加以及心室结构的改变。心肌梗死后心室重构的进一步发展可导致心衰、猝死,是远期发生心源性死亡最重要的危险因素之一。在心室重构过程中,心肌细胞凋亡起着极其重要的作用。细胞凋亡是机体正常细胞在受到生理和病理性刺激后出现的一种自发死亡过程,是一个主动、高度有序、基因控制及一系列酶参与的过程。细胞凋亡在保证多细胞生物健康生存过程中扮演着关键角色,机体在产生新细胞的同时,衰老和突变的细胞通过凋亡机制被清除,使器官和组织得以正常的发育和代谢。过度的细胞凋亡导致巨噬细胞吞噬凋亡细胞能力下降,引起凋亡细胞周围的正常细胞代谢异常,使基质金属蛋白酶等表达增强,导致细胞外基质异常降解,进而引起心肌纤维化及心室重构。凝集素样氧化低密度脂蛋白受体(LOX-1),是一种ox-LDL新型受体,生理情况下表达于血管、内皮组织和血管丰富的器官,如胎盘、脑和肺,具有高度的配体特异性,能介导细胞摄取和代谢ox-LDL以及ox-LDL对损伤效应。研究表明LOX-1介导心肌缺血再灌注、血栓、动脉粥样硬化形成以及高血压性心室重构。LOX-1可能是心血管疾病防治的新靶点。细胞外信号调节蛋白激酶(ERK1/2)、应激活化蛋白激酶(Stress aetivated protein kinasee,SAPK或c-JunN N-terminal kinase,JNK)和P3 8MAPK是人体中丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated Protein kinase,MAPK)的家族成员。丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)是主要的跨膜信号转导通路,存在于大多数细胞中,可以调节广泛的细胞活性,是缺血、低氧、激素、生长因子以及细胞因子等各种细胞外信号刺激诱导基因表达、细胞增殖等核反应的共同通路或汇聚点,一旦被激活后,可以调控细胞的生长、增殖、分化和凋亡。已被证明是心室重构过程中重要的信号分子,通过基因靶向表达这些分子能启动心室重构。NF-κB是一类具有多向转录调节作用的核蛋白因子,存在于各种组织细胞中,激活后参与多种基因的转录调控,在免疫、炎症、氧化应激、细胞增殖、细胞凋亡等生理病理过程中发挥作用。近几年研究表明,NF-κB与细胞凋亡的关系密切,它参与多种凋亡相关基因的转录调控,具有抑制细胞凋亡作用及促细胞凋亡的双向作用,这主要取决于不同刺激因素及细胞类型,并与激活的NF-κB亚单位的种类及数量有关,当细胞发生凋亡时,P65(RelA)表达明显增高。Caspase 3是细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶,它处于凋亡有序级联反应的下游,是最重要的效应型Caspase,是Caspase家族中的最重要的凋亡执行者之一,是细胞凋亡过程中的主要效应因子,是多种凋亡刺激信号传递的汇聚点,它的活化是凋亡进入不可逆阶段标志。AMI属中医的“胸痹”、“心痛”、“真心痛”范畴,其发病机理为胸阳不足,气机不畅,瘀血、痰浊阻滞,导致心脉挛急或闭塞,其治疗原则不外“通、补”二义,即补益心气以恢复血液运行。参鞠方是临床上治疗心梗后心室重构的验方,该方从气虚、痰浊、血瘀等多角度考虑,由生脉散、越鞠丸、失笑散组成,用于治疗心梗后心室重构,在临床上取得良好疗效。既往研究结果表明,作为LOX-1信号通路下游的PKC、ERK1/2、NF-κB分子是参鞠方抗心室重构心肌细胞肥大和心肌细胞外基质纤维化的作用靶点,参鞠方对PKC、ERK1/2、NF-κB分子调控心肌细胞凋亡影响如何,值得进一步研究;在心梗后心室重构的过程中可能存在着LOX-1信号通路的激活,而参鞠方可能通过抑制LOX-1信号通路抗心肌细胞凋亡,延缓心室重构的发展。目的本研究旨在探讨参鞠方对心梗后心肌细胞凋亡的影响及其与LOX-1信号通路的相关性,从而为心梗后心室重构的发病机制提供新的思路,为参鞠方抗心梗后心肌细胞凋亡提供新的作用靶点。方法1.大鼠心肌梗死模型制作与分组选用SPF级雄性成年Wistar大鼠36只,体重在150g-200g之间,结扎大鼠左冠状动脉构造大鼠心肌梗死模型,随机分成2组:模型组、参鞠方组,另设假手术组18只,开胸后仅挂线而不结扎冠状动脉。术后当天开始喂药,参鞠方组:5.5g/kg-d参鞠方水煎液灌胃;假手术组和模型组:蒸馏水灌胃。连续喂养12周。2.大鼠一般生命状况及心脏形态学观察喂药过程中观察大鼠一般生命状况,包括进食量、毛发情况、活跃度,12周后处死大鼠,剪下心脏,肉眼观察心脏大体形态,同时用标尺测量心脏大小。3.大鼠心肌组织HE染色及TUNEL染色HE染色:将切片常规脱蜡,依序用苏木精染色,盐酸乙醇溶液分化,氨水反蓝,伊红染色,梯度浓度乙醇脱水,二甲苯透明,最后用树胶封片,镜下观察心肌改变。TUNEL染色:将切片脱蜡、水化,洗涤后吸去水分,加入反应液(TdT酶和-dUTP)反应,再次洗涤,用FITC反应液标记,经过PI复染后封片。镜下观察,凋亡细胞呈现出黄棕色。4.Caspase 3活性检测探针溶液可在新鲜培养液中稀释到所需浓度,以此染色液更换细胞培养液或细胞灌流液。二氢乙啶终浓度可选择在1μmol～10Oμmol的范围。孵育可在37℃或室温进行,要求避光。孵育结束后,用新鲜溶液清洗细胞或组织。放置荧光显微镜下观察。不同荧光可激发细胞呈现不同颜色。5.Western blot法检测心肌组织中相关蛋白表达在各组蛋白样品中加入上样缓冲液,10%SDS-PAGE电泳,转膜,脱脂奶粉封闭 90min,加入 LOX-1,BCL-2,BAX,P38、P-P38,ERK1/2、P-ERK1/2,P65、β-actin多克隆抗体,4℃孵育过夜,1×TBS液洗涤3次,10min/次,加入二抗,37℃孵育,1×TBS液洗涤3次,1Omin/次。ECL化学发光试剂盒显色,Kodak全光谱多功能活体成像系统曝光。Image tool V3.0图像分析软件读取条带灰度值。实验重复4次。6.H9C2心肌细胞培养及分组将H9C2大鼠心肌细胞株用培养基(10%FBS的低糖DMEM)培养于孵箱中,分为6组:正常组(A:加10%胎牛血清的低糖DMEM)、H202组(B:100μmol/L H202和10%胎牛血清的低糖DMEM)、参鞠方低、中、高剂量组(C、D、E:分别为含 0.5mg/mL,1mg/mL,2mg/mL 的参鞠方煎剂、和100μmol/L H2O2、10%胎牛血清的低糖 DMEM);LOX-1 阻断剂组(F:250mg/L κ-Carrageenan、100μmol/LH2O2、10%胎牛血清的低糖DMEM)。加药刺激后继续培养24h。7.Hoechst33258染色法检测参鞠方对H2O2诱导细胞凋亡作用Hoechst33258染料可透过细胞膜并对DNA染色而发出强烈的蓝色荧光。将心肌细胞按2×105/ml的密度用含10%FBS的低糖DMEM培养基接种于6孔板,每孔种植2ml。培养48h～72h,每24h换液一次,后改以含2%FBS的低糖DMEM培养基进行低血清培养24h后,对心肌细胞进行药物处理。分组同前。室温下70%乙醇固定细胞30 min,PBS冲洗2次,加入含有10μg/mL hoechst 33258的PBS,室温下继续培养30min。用荧光显微镜进行观察。细胞核浓聚的细胞被标注为凋亡细胞。8.Annexin V-FITC/PI染色法检测参鞠方对H2O2诱导细胞凋亡作用用胰酶将贴壁细胞消化,收集悬浮液,按2000g/min速度离心5min,弃培养基;用冷PBS洗涤细胞2次;用400ul1×BindingBuffer悬浮细胞,浓度大约为1×105cells/ml;在细胞悬浮液中加入5ulAnnexin V-FITC,轻轻混匀后于2-8℃避光条件下孵育15min。加入10ul PI后轻轻混匀于2-8℃避光条件下孵育5min;在1h内用荧光显微镜检测,Annexin V-FITC荧光信号呈绿色,PI荧光信号呈红色。9.Western blot 法检测心肌组织中 LOX-1,BCL-2、BAX、ERK1/2、P-ERK1/2、P38、P-P38、P65、β-actin 蛋白的表达NP40裂解液提取心肌细胞中的蛋白,离心。BCA法测定提取上清液中的蛋白质浓度,在各组蛋白样品中加入上样缓冲液,其他步骤同前。10.统计方法采用SPSS 13.0统计软件进行分析,所有数据均采用均数±标准差(x±S)表示,各组均数比较使用one-way ANOVA。方差齐时,组间比较用Bonferroni;方差不齐时用Welch稳健估计,再用T3方法两两比较。P<0.05表示差异具有统计学意义。结果1.制作心梗大鼠模型过程中总共死亡5只,随机分组(模型组16只,参鞠方组15只),喂药过程中总共死亡3只(模型组1只,参鞠方组2只)。2.与模型组相比,经参鞠方煎剂灌胃后,能明显改善AMI模型大鼠的一般生命状况;假手术组大鼠心脏表明光滑,体积较小,模型组大鼠心脏较假手术组明显增大,梗死区域变白,形态不规则,参鞠方组大鼠心脏变形较模型组轻,梗死区域较模型组小,形态稍规则。3.大鼠心肌组织染色结果提示,假手术组心肌着色均匀,横纹排列整齐,显示正常心肌细胞形态;模型组心肌梗死区大,梗死区室璧变薄,形态不规则;参鞠方组大鼠心肌梗死区域较模型组明显变小,伴纤维增生,非梗死区心肌变性程度减轻,肌原纤维排列较模型组规则,计算心肌细胞凋亡率提示参鞠方组较模型组明显下降(P=0.000)。4.Caspase 3活性检测结果提示,模型组中Caspase 3酶活性为假手术组的3.9倍(P＜0.01),参鞠方组中Caspase3酶活性也出现升高情况,为假手术组的2.3倍(P＜0.01),但较模型组明显降低(P＜0.01)。5.Westernblot结果提示,模型组中LOX-1蛋白表达明显比假手术组升高(P＜0.01)。与模型组相比,参鞠方组可明显降低心肌梗死后心肌组织中LOX-1蛋白表达(P<0.01)。同样,P-P38、P-ERK1/2、P65蛋白在心肌组织中表达呈现出LOX-1表达同样的趋势(P<0.05)。相反,参鞠方组中BCL-2/BAX比率较模型组明显升高(P<0.01)。6.Hoechst33258染色结果提示,H2O2组细胞出现凋亡形态学改变,而参鞠方不同剂量组和LOX-1阻断剂组凋亡程度较H2O2组减轻(P＜0.01),且发现不同浓度的参鞠方组对心肌细胞活力有不同程度提高,细胞活力与参鞠方浓度呈正相关。实验结果表明参鞠方可以降低H2O2诱导的H9C2心肌细胞凋亡。7.Annexin V-FITC/PI染色结果显示,正常组中未见明显红、绿色荧光,H2O2组中绿色和红色荧光明显增多,不同浓度参鞠方组及LOX-1阻断剂组中均出现不同程度的红、绿色荧光,程度较H2O2组减轻,且随着参鞠方浓度的增高,红、绿色荧光程度逐渐减轻,以参鞠方高剂量组程度最轻,提示参鞠方可以减轻H2O2诱导的心肌细胞凋亡,以参鞠方高剂量组效果最佳,与LOX-1阻断剂组作用效果相当。8.Western blot结果提示,H2O2组中LOX-1蛋白表达明显高于正常组(P＜0.01),而参鞠方不同剂量组及LOX-1阻断剂组中LOX-1蛋白比H2O2组则有明显降低(P＜0.01)。H2O2组中检测心肌细胞BAX蛋白表达明显高于正常组,BCL-2蛋白表达和BCL-2/BAX比值低于正常组。不同剂量参鞠方组及LOX-1阻断剂组中BAX蛋白表达明显少于H2O2组,BCL-2蛋白表达和BCL-2/BAX比率明显高于H2O2组(P＜0.01),以高剂量组较为明显,同样,P-P38、P-ERK1/2、P65蛋白在各组中表达与LOX-1表达呈现同样趋势(P＜0.05)。结论参鞠方可抑制LOX-1信号通路,从而降低其下游P38、ERK1/2等信号分子表达,抑制NF-ΚB信号通路中亚基P65的表达,提高BCL-2/BAX比率。因此,我们认为,参鞠方可以通过抑制LOX-1信号通路,保护心肌细胞,减轻心肌细胞凋亡,干预心肌梗死后心室重构的病理过程,延缓心室重构的进展。