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近年来中国经济的高速发展,引发越来越多的环境污染问题,尤其石油的广泛使用引起的环境问题及修复技术成为研究热点。目前在针对石油污染土壤的植物修复技术因其美观、无二次污染等特性得到广泛关注。本课题组前期研究发现,耐受石油污染植物紫茉莉在石油污染胁迫下能高表达的两种小热休克蛋白MjsHsp18.2和MjsHsp17.7,通过RACE(Rapid-amplification of cDNA ends)技术、融合PCR及2A肽技术,构建了这两个基因的表达载体(pYES2-MjsHsp18.2-Flag、pYES2-MjsHsp17.7-HA及pYES2-MjsHsp-fusion),并获得了酿酒酵母转化菌株。在此基础上本课题开展了MjsHsp在酵母内质网应激过程中的作用机制,为揭示该基因在植物石油胁迫逆境响应中的功能奠定基础。研究结果如下:1.生物信息学预测MjsHsp18.2基因编码了161个氨基酸、蛋白质分子量为18.2 kDa:MjsHsp17.7基因编码了158个氨基酸、蛋白质分子量为17.7 kDa MjsHsp18.2和MjsHsp17.7的结合位点有所不同,表明两个基因编码不同结构、功能的蛋白质。这两种小热休克蛋白均定位于细胞质与细胞核中,可以与蛋白质、离子、有机环和杂环等结合,参与生物的代谢过程、蛋白质折叠和非生物胁迫等刺激响应。2.通过实时荧光定量PCR分析石油胁迫下紫茉莉幼苗根部的MjsHsp18.2和MjsHsp17.7基因表达规律,表明MjsHsp18.2在浓度为30 g/kg石油处理12 h时表达量最高,而MjsHsp17.7在20 g/kg石油处理24 h时表达量最高。转化菌株的Western blot结果证明酿酒酵母的转化成功,且敏感性实验验证重组菌株的抗逆性强于INVSCI1。3.为了探究小热休克蛋白在逆境中与内质网、UPR反应、细胞凋亡以及氧化应激之间的关系。利用衣霉素处理模拟逆境环境,实时定量测定INVSCI1菌株及转化菌株中BiP及PDI1的相对表达量以及与不同时间处理的酿酒酵母SOD活力变化。结果表明,伴随内质网应激,各菌株BiP及PDI1表达量均有升高,且转化菌株缓解ER Stress的能力优于INVSCI1菌株,转化菌株的SOD酶活性高于INVSCI1。对衣霉素处理后酿酒酵母菌株中Yca1的表达量测定以及细胞存活率、细胞凋亡率的实验结果发现,转化菌株的Yca1表达量显著低于INVSCI1菌株,且细胞活性实验结果显示转化菌株具有更好的活性。从分子和细胞水平上证明转化菌株具有降低细胞凋亡率的活性。MjsHsp17.7菌株在分子水平上的实时测定中均有明显优势即缓解能力最强,MjsHsp18.2菌株则在酶活测定与细胞水平上实验结果优于MjsHsp17.7菌株即活性最高。综上所述,在酿酒酵母中过表达的紫茉莉小热休克蛋白有助于减少衣霉素所带来的内质网应激,降低细胞凋亡提高细胞抗逆性,而转基因的菌株MjsHsp17.7与MjsHsp18.2行使不同的生物学功能。