玉米赤霉烯酮(ZEA)和脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)是我国谷物及饲料中常见的霉菌毒素。ZEA的主要毒性为生殖毒性,DON的主要毒性为肠毒性,另外,两种毒素均具有不同程度的免疫毒性。目前,对ZEA和DON联合免疫毒性方面的报道不多,鉴于两者自然共存的现实,有必要搞清两者的联合免疫毒性效应。本试验以小鼠原代脾脏T淋巴细胞为材料,刀豆蛋白A(Con A)为T细胞活化刺激剂,研究了 ZEA、DON及其联合染毒对体外培养T淋巴细胞免疫功能及凋亡的影响。1.ZEA、DON及其联合染毒对小鼠T淋巴细胞活力及超微结构的影响采用免疫磁珠阴性分选技术从4-5周龄的BALB/c小鼠脾脏中分离获得原代T淋巴细胞。设立对照组(不含 Con A)、Con A(5mg/L)组、Con A(5mg/L)+ZEA(10、20 及 40 μM)组、Con A(5 mg/L)+DON(0.5、1 及 2 μM)组、Con A(5 mg/L)+(ZEA+DON组)(10μM ZEA+0.5μM DON、20 μM ZEA+1 μM DON、40μM ZEA+2 μM DON),染毒24 h后,CCK-8法检测T细胞相对活力;染毒48 h后,透射电镜、扫描电镜观察T细胞超微结构损伤。结果显示,染毒24h后,与对照组相比,ConA组T细胞相对活力极显著升高(p<0.01);与ConA组相比,不同浓度ZEA、DON处理组T淋巴细胞活力均显著或极显著降低(p<0.05或p<0.01),并呈剂量-效应关系;与Con A组相比,不同浓度ZEA和DON联合处理组细胞活力均极显著降低(p<0.01);与不同浓度ZEA组相比,其对应浓度联合处理组T细胞相对活力均显著或极显著降低(p<0.05或p<0.01);与不同浓度DON组相比,10 μM ZEA+0.5μM DON联合处理组T细胞相对活力显著降低(p<0.05),其余联合处理组未发生显著变化(p>0.05)。透射电镜观察显示,Con A刺激48 h后,T细胞细胞膜表面的微绒毛增多,线粒体的数量增多;加入20 μM ZEA、1 μM DON后,膜表面微绒毛消失,细胞核异染色质增多,线粒体肿胀;加入20 μMZEA+1μM DON后,细胞膜不再完整,空泡化增多,线粒体及细胞形态结构损伤加剧。扫描电镜观察显示,ConA刺激48 h后,T细胞体积增大,细胞膜表面微绒毛增多;加入20 μM ZEA、1μMDON后,细胞膜受到破坏不再完整;加入20μMZEA+1μMDON后,细胞膜损伤加剧。结果说明,ZEA、DON可抑制T细胞细胞活力和破坏细胞超微结构,毒素联合作用具有协同效应。2.ZEA、DON及其联合染毒对小鼠T淋巴细胞活化及其细胞毒性功能的影响以原代小鼠T淋巴细胞为材料,设立对照组(不含Con A)、ConA(5 mg/L)组、ConA(5mg/L)+ZEA(10、20 及 40μM)组、ConA(5mg/L)+DON(0.5、1 及2μM)组、ConA(5mg/L)+(ZEA+DON)组(10μMZEA+0.5μMDON、20μMZEA+1 μM DON、40μM ZEA+2μM DON),染毒24 h后,流式细胞术检测CD25、ICOS表达情况;染毒48 h后,CBA检测细胞因子IL-2、TNF-α分泌情况,ELISA检测穿孔素(PFP)、颗粒酶A(GZMA)合成总量。结果显示,染毒24 h或48 h后,与对照组相比,Con A组CD25和ICOS表达率,IL-2和TNF-α分泌、PFP和GZMA合成总量均极显著升高(p<0.01);与ConA组相比,不同浓度ZEA、DON处理T淋巴细胞后,CD25和ICOS表达率、IL-2和TNF-α分泌、PFP和GZMA合成总量均显著或极显著降低(p<0.05 or p<0.01),并呈剂量-效应关系;与Con A组相比,不同浓度ZEA和DON联合处理组CD25和ICOS表达率、IL-2和TNF-α分泌、PFP和GZMA合成总量均显著或极显著降低;与不同浓度ZEA、DON组相比,其对应浓度联合处理组CD25和ICOS表达率、IL-2和TNF-α分泌、PFP和GZMA合成总量均显著或极显著降低(p<0.05 orp<0.01)。结果说明,ZEA、DON 可抑制 T 淋巴细胞 CD25、ICOS、PFP、GZMA 的表达,IL-2、TNF-α的分泌,从而影响T淋巴细胞IL-2的自分泌作用、共刺激作用及穿孔素颗粒酶途径的细胞毒性功能,毒素联合作用具有不同程度的协同或拮抗效应。3.ZEA、DON及其联合染毒对小鼠T淋巴细胞凋亡率、Fas/FasL通路、线粒体通路、MAPK通路相关蛋白的影响以原代小鼠T淋巴细胞为材料,设立对照组(不含Con A)、ConA(5 mg/L)组、ConA(5 mg/L)+ZEA(10、20 及 40 μM)组、ConA(5 mg/L)+DON(0.5、1 及 2 μM)组、Con A+ZEA+DON 组(5 mg/L ConA+10μM ZEA+0.5μM DON、5 mg/L ConA+20μM ZEA+1μMDON、5mg/LConA+40μMZEA+2μMDON),染毒 24h后,流式细胞术检测T细胞凋亡率;设立对照组(不含Con A)、Con A组、Con A+ZEA共处理组(Con A+10、20 或 40 μM ZEA)、Con A+DON 共处理组(ConA+0.5、1或2μM DON)、Con A+ZEA+DON共处理组(ConA+20μM ZEA+1 μ DON),染毒 24 h 后,Western Blot 检测 Fas/FasL 通路相关蛋白(Fas、FasL、Cleved Caspase-8)、线粒体通路相关蛋白(Cleved Caspase-9、Cleved Caspase-3)表达量、Bax/Bc1-2 比值和 MAPK 通路相关蛋白(ERK1/2、JNK1/2、p38)磷酸化水平。结果显示,染毒24 h后,与对照组相比,Con A组凋亡率上升但差异不显著;与ConA组相比,不同浓度ZEA、DON组凋亡率显著或极显著上升(p<0.05或p<0.01),并呈剂量-效应关系;与Con A组相比,不同浓度ZEA和DON联合处理组凋亡率极显著上升(p<0.01);与不同浓度ZEA组相比,其对应联合处理组细胞凋亡率极显著上升(p<0.01);与不同浓度DON组相比,其对应联合处理组细胞凋亡率均上升但差异不显著(p>0.05)。与ConA组相比,Fas/FasL通路相关蛋白Fas、FasL、Cleved Caspase-8表达量显著或极显著上升(p<0.05或p<0.01),线粒体通路Bax/Bc1-2比值、Cleved Caspase-9,-3蛋白表达量显著或极显著上升(p<0.05或p<0.01),MAPK通路相关蛋白MEK1/2、ERK1/2、JNK1/2磷酸化水平显著或极显著上升(p<0.05或p<0.01)。结果表明,ZEA、DON能诱导T细胞凋亡,毒素联合作用具有协同效应;ZEA、DON单独或联合暴露会激活T细胞Fas/FasL通路、线粒体通路、MAPK通路。为研究JNK在线粒体通路中的调控作用,20 μM ZEA、1μM DON分别与10μM SP600125单独或联合作用于Con A刺激的T淋巴细胞24 h,Western Blot检测JNK1/2磷酸化水平,Bax、Cleved Caspase-9,-3的蛋白表达量。结果显示,与ZEA组相比,ZEA与 SP600125 联合处理组 JNK1/2 磷酸化水平,Bax、Cleved Caspase-9、Cleved Caspase-3蛋白表达量显著降低(p<0.05);与DON组相比,DON与SP600125联合处理组JNK1/2磷酸化水平,Bax、Cleved Caspase-9蛋白表达量显著降低(p<0.05)。结果表明,JNK参与调控线粒体通路。结论,ZEA、DON可以造成T淋巴细胞活力的下降和超微结构的损伤,同时抑制T细胞共刺激分子、细胞因子的表达,抑制T细胞的活化及杀伤效力;ZEA、DON可诱导T细胞的凋亡,ZEA、DON可通过Fas/FasL通路、线粒体通路参与调控T淋巴细胞凋亡;JNK参与调控细胞凋亡的线粒体通路。ZEA与DON联合暴露具有协同效应。