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蓖麻毒素（Ricin Toxin,RT）是从大戟科植物蓖麻的种子中提取的一种毒素蛋白，具有强烈的细胞毒性。蓖麻毒素的分子量为65000，由两条多肽链组成，其间通过二硫键相连接。A链是活性链，分子量为31000，B链分子量为33000，具有凝集素的功能，其上有两个特异的半乳糖凝集部位。蓖麻毒素的一级结构已由Funatsu等完成，结果显示，A链由363个氨基酸残基组成，只有两个Lys残基，一个位于N端第四位，一个位于C端附近，对A链的毒性作用至关重要。B链是由259个氨基酸组成的序列，它能特异性地识别细胞膜上特定的含有末端半乳糖的糖蛋白或糖脂受体。B链本身几乎没有毒性，主要作用就是识别和结合细胞表面的受体，B链上结合位点的构成与酪氨酸或含有ε-NH2的赖氨酸残基有关。蓖麻毒素经受体介导的内吞方式进入细胞，在细胞内通过逆分泌途径转运至内质网，然后A链和B链分开，A链转位至细胞浆，在胞浆中和核糖体的60S大亚基结合，通过其特异的N-糖苷酶活性，催化切断60S亚基28SrRNA中第4234位腺嘌吟与核糖分子之间的糖苷键，这一嘌吟的脱落可导致整个核糖体的失活，从而影响需核糖体参与的氨基酰-tRNA的结合和肽酰-tRNA的转位过程，最终导致蛋白质合成障碍，引起细胞的死亡。蓖麻毒素具有强烈的细胞毒性，具有抗肿瘤的应用前景。为了提高特异性，近年来，研究的热点在于将A链和特异性的单克隆抗体结合，制成免疫毒素，将毒素特异性地靶向运送至肿瘤细胞，可以减少毒素对正常细胞的损伤。这方面的研究取得了可喜的进步，但还有不少问题有待于进一步的研究。 本研究主要集中于从天然蓖麻种子中提取和纯化蓖麻毒素，进行生化鉴定和生物学活性检测，通过细胞培养，观察其对正常小鼠成纤维细胞NIH 3T3和结肠癌细胞Colon205的作用。以白血病细胞K562和大肠癌细胞SW480为实验对 浙江大学硕土学位论文 象，比较其对不同肿瘤细胞的杀伤作用。 一、蓖麻毒素的提取和纯化 根据Nicolson和Blaustein的方法稍加改进，将去壳的蓖麻籽匀浆，以0刀IM， pH－7．2的 PBS提取，4吐过夜，离心并沉淀，加硫酸镣至 40％饱和度，40C过 夜，离心，继续加硫酸铰至 80％饱和度，4七放置4小时，离心，将沉淀物以 0刀IM，pH。7．2的 PBS溶液溶解，即得粗提液。取粗提液 510ml缓慢通过 SePharose 4B亲和层析柱Q cm X 25 cm)使其结合。用蛋白自动检测仪检测 ohannacia)记录280urn波长下的吸收峰。由于蓖麻毒素和凝集素与Sepharose 4B有亲和作用，首先以0．of M，pH刁．二的PBS洗脱，可洗脱杂蛋白。然后， 以0～0．5 M乳糖梯度洗脱，可将蓖麻毒素和凝集素同时洗脱。收集280 urn处 洗脱峰，是为蓖麻毒素和凝集素的混合物。根据文献报道，凝集素的分子是为 120000左右，而蓖麻毒素的分于量约在60000～65000之间。根据它们分于量大 小不同，我们采用Sephadex－G100分于筛将其分离。由于凝集素分子量较大， 所以，首先被洗脱，出现第一个洗脱峰，而蓖麻毒素分子量小，集中在第二个 洗脱峰。 二、蓖麻毒素的鉴定 根据文献报道，蓖麻毒素的分子量在60000～65000之间，由A，B两链组成。 链之间由二硫键连接，进行 10％SDS－PAGE电泳，观察其电泳行为。样品处理 过程中，如加还原剂，可出现二条电泳带，分子量分别为31000和33000；不加 还原剂时出现一条电泳带，并可估计其相应的分子量65000。 三、。活性检测 酶联仪测定掳拍酸脱氢酶活性，其原理是掳琅酸脱氢酶（SDH）是三梭酸 循环中的重要酶，存在于线粒体内膜上，是反映线粒体功能的敏感指标，线粒 体是细胞的供能场所，其功能的丧失意味着细胞生命的结束。因此，可以根据 3 浙江大学硕士学位论文 SDH的活性推知细胞的活性。MTT法即利用噬哇蓝染料，化学名 3．（4，5．H 甲基暖哇．2）．2，5．二苯基四氮哇澳盐，简称 MTVI’，来显示细胞线粒体内的掳 琅酸脱氢酶活性，在有酶的地方，酶作用于底物进行脱氢，脱下的氢与Mry作 用，将氧化型的 MTh还原成难溶性的蓝紫色结晶物（formazan）并沉积在细胞 中，而死细胞无此功能。以二甲基亚枫（DMSO）溶解细胞中的染色结晶物。 用酶联免疫检测仪在 570 urn波长处测定吸光值，在一定细胞数量范围内，M’I’T 结晶物形成的量与细胞数成正比，可间接反应活细胞数。该方法己广泛用于生 物活性因子的活性检测。 1．蓖麻毒素对乳腺癌细胞生长曲线的影响 每种细胞都有比较稳定的生长增殖特性。?