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在本研究室获得的棉纤维细胞特异表达基因GhManA2基因cDNA序列的基础上,据该cDNA序列设计特异引物分别筛选陆地棉恢复系0-613-2R和亚洲棉江陵中棉基因组BAC文库,获得阳性克隆。进一步以阳性克隆为模板,利用染色体步移技术和普通PCR技术获得了该基因在不同棉种中的启动子区序列和基因序列。利用陆地棉A-亚组的基因启动子序列和gus报告基因构建了该启动子区域的4个缺失融合载体,用基因枪轰击法转化0 DPA胚珠后进行离体培养和农杆菌介导法转化开花后不同时期棉花胚珠,研究gus基因的瞬时表达以分析启动子各区段的功能。具体实验结果如下:(1) GhManA2基因在5 DPA的棉纤维中开始表达,对其0～25 DPA的定量PCR显示该基因在5～25 DPA都有表达:5 DPA时表达量就相对比较高,约是10 DPA和15 DPA的6/5倍;10 DPA和15 DPA的表达量差不多;20 DPA的表达量约为10 DPA和15 DPA的2倍;25 DPA的表达量最高,约为10 DPA和15 DPA的6倍多。表明GhManA2基因和棉纤维伸长、次生壁加厚均有关系。(2)利用该cDNA序列设计特异引物分别筛选陆地棉恢复系0-613-2R和亚洲棉江陵中棉基因组BAC文库。从陆地棉恢复系0-613-2R文库中获得阳性克隆3个(G13、B7、B14),从亚洲棉江陵中棉文库中获得阳性克隆2个(F20和M12)。(3)首先以G13为模板,经两轮染色体步移,首次从棉花陆地棉恢复系0-613-2RBAC文库中克隆到了GhManA2基因的上游序列,片段全长2075 bp。用启动子预测软件Neural Network Promoter Prediction分析GhMahA2基因启动子区域,结果表明在-778～-680 bp和-448～-370 bp两处可能存在一系列基础启动子序列,它们各有一个最高可能性为99.4985%和93.3890%的待验证基础启动子序列。进一步用PlantCARE对5’上游远端调控序列进行顺式作用元件分析,发现了TATA-box、CAAT-box、Skn-1-motif、GARE-motif、HSE、ERE、ABRE、G-box、Ⅰ-box等多种重要元件。(4)依据单克隆G13中GhManA2基因上游序列设计引物,预期启动子扩增长度1797bp。从其他4个阳性克隆F20、M12、B7、B14中扩增启动子序列,获得的序列长度分别为:1795 bp、1795 bp、1821 bp、1821 bp。5个克隆的启动子区同源关系分析显示:G13,F20,M12聚为一类;B7,B14聚为另一类。由于F20,M12克隆来自亚洲棉江陵中棉文库,推测G13属于四倍体A-亚基因组,B7和B14属于四倍体D-亚基因组。(5)克隆了5个单克隆及雷蒙德氏棉中GhManA2的基因组序列,并对其基因结构进行了分析,结果显示不同来源的GhManA2基因由11个外显子和10个内含子组成。5个单克隆及雷蒙德氏棉中GhManA2基因的开放阅读框长度均为2931 bp,这部分序列同源分析的结果与5个克隆中GhManA2的启动子序列同源分析结果相同。对5个单克隆及雷蒙德氏棉中GhManA2基因10个内含子的序列各自进行分析,结果显示内含子具有不稳定性,在四倍体棉花的进化过程中不同亚组的相同基因间存在同化或殖民化现象。对本实验室登录的GhManA2 cDNA序列的同源分析显示它属于四倍体D-亚基因组,因此推断GhManA2启动子在棉花D-亚基因组中具有表达活性。(6)基于G13的GhManA2基因启动子序列,利用PCR技术获得了GhManA2基因的4个缺失启动子片段(1857 bp,1468 bp,869 bp,245 bp),分别取代植物表达载体pBI121上驱动gus的35S启动子,构建了4个缺失融合载体,其上所含缺失片段从大到小依次为:pBI121-M1、pBI121-M2、pBI121-M3、pBI121-M4。在载体构建的基础上,用农杆菌转化法和基因枪法转化棉花胚珠,研究各缺失载体的gus瞬时表达。GUS组织化学分析表明:两种转化方法得到的结果相似;除了不合有预测的基础启动子区域的pBI121-M4载体检测不到GUS活性,其余缺失融合载体均检测到了GUS活性;与含有35S启动子的pBI121转化胚珠相比gus活性普遍较弱,而且只能在棉纤维细胞中表达,显示该启动子具有纤维特异性。(7)依据GhManA2基因上游顺式元件分析结果及各缺失载体的瞬时表达检测结果,推测步移所得2075 bp序列中,纤维特异表达启动子区域位于-953～-309 bp(长645 bp)区间内。结合GhManA2基因的定量PCR结果,预测该启动子在纤维的5～35 DPA都表达,在次生壁加厚期达表达高峰且表达水平显著高于伸长期。