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棘孢曲霉β-葡萄糖苷酶I(Aspergillusaculeatusβ-glucosidase,ABGL)是GH3家族的重要成员之一，其水解性能优良，能水解多种糖苷底物，如pNPG、七叶苷和纤维二糖等。外源添加ABGL可辅助纤维素酶水解，降低甘蔗渣水解体系纤维二糖的含量，解除纤维素酶的抑制作用，具有很好的应用前景。FN3区域位于糖苷水解酶（GH）家族的C端，功能尚不清楚，可能对酶水解底物的能力有重要影响；研究指明ABGL催化葡萄糖与不同链长的脂肪醇逆水解合成烷基糖苷时，底物碳链越长，其产率却逐步降低。因此本研究使用毕赤酵母表达系统通过构建多拷贝重组菌和混合补料高密度发酵技术，提高外源蛋白ABGL的表达量，并初步应用于甘蔗渣的水解研究，希望能为降低工业上纤维素酶处理的成本提供依据。同时通过同源建模和分子对接的方法，结合突变实验研究FN3区域与水解性能的相关性，分析逆水解合成不同碳链长度的烷基糖苷的产率特异性的原因，对于研究ABGL的水解性能和分子模拟筛选底物配体具有指导意义。本研究具体的研究内容及结果如下：1）构建多拷贝重组菌和高密度发酵混合补料技术提高蛋白表达量本研究构建三拷贝ABGL的重组质粒，转化酵母后通过改良的七叶苷显色平板，筛选得到5株黑色水解圈较大的毕赤酵母菌株GS115/pHKA-(ABGL)3，诱导表达120小时最高酶活为83.15U/mL，较文献报道提高3.35倍。在摇瓶水平诱导阶段混合补料研究中，甲醇与甘油的体积比为40比1，更有利于多拷贝毕赤酵母菌株表达ABGL。在10L罐水平的混合补料发酵研究中，混合补料（甲醇：甘油=40：1）的产酶量在诱导表达120小时酶活为1013U/mL，较单独甲醇补料提高约14.5%。毕赤酵母50L罐水平高密度发酵表明，多拷贝菌株GS115/pHKA-(ABGL)3酶活在诱导表达120小时为979U/mL，较单拷贝菌株提高2.94倍，且蛋白质浓度可以达到12g/L。2） ABGL辅助纤维素酶水解纤维素初步探讨了ABGL协助纤维素酶水解纤维素的能力，当ABGL酶量与纤维素酶酶量的比例为2.5:1时效果最佳，葡萄糖产量较对照组提高13.91%。3） ABGL的FN3区域功能初步分析ABGL与丁基、己基、辛基、癸基和十二烷基β-D-葡萄糖苷配体的分子对接表明，底物碳链越长，催化区域的质子传递链的强度逐步受到限制，同时Entropic Energy（熵值）越高，打分项Jain的分值和负结合能的pose数逐步越少，理论上说明对接强度逐渐降低。突变实验表明ABGL突变截短蛋白中只有a720能够水解pNPG、七叶苷和纤维二糖底物，不过水解能力减弱，而其它突变蛋白的水解能力都被消除，表明FN3区域对ABGL与底物的结合能力具有较大影响。分子对接研究中，ABGL突变截短蛋白Asp262-OH和Glu491-OH与α碳之间的距离均大于ABGL的这两项距离，且打分项普遍小于ABGL的打分项，分子模拟也说明FN3区域对底物的水解能力具有重要作用，切断FN3区域会降低蛋白的水解能力。