研究背景及目的白血病是最常见的儿童恶性肿瘤之一,约占儿童肿瘤的1/3。尽管白血病的发病原因目前尚不清楚,已有研究显示一些产前染色体和基因异常如21三体和TEL-AML重排有增加儿童患白血病风险的倾向,而且有关双胞胎白血病患者的研究显示白血病的发生可以起始于子宫内阶段。Ras是一种膜联小分子GTP酶,在细胞信号转导中发挥重要作用。Rras基因的12、13密码子的突变可引起Ras信号的增强,从而导致Rras蛋白的持续激活,引起细胞增殖分化、恶性转化等改变。Pten是PI3K-Akt信号通路的负性调节蛋白,在细胞周期、系别分化、迁移和造血干细胞、祖细胞的功能中发挥重要作用。目前研究表明儿童白血病中存在癌性Kras的表达和Pten的缺失等基因突变。因而我们提出一种假设：癌性Kras基因表达和Pten基因的缺失这两种基因突变可能作为早期事件发生在胚胎从而对出生后白血病的发生发挥作用。但目前存在的癌性Kras基因表达和Pten基因的缺失的小鼠模型研究大多应用成鼠的骨髓细胞,而为检验这一假设成立与否,需建立一种于胚胎阶段始可引起造血系统该两种基因突变发生的小鼠模型。Cre转基因小鼠可敲除特异组织中两侧带有Loxp位点的基因序列,而Vav-iCre (?)、鼠中Cre基因的表达由Vav基因控制。Vav基因主要表达于成鼠的造血系统及胚胎的造血干细胞来源的造血祖细胞,因而Vav-iCre中重组酶主要作用于造血器官的造血细胞,是用来建立胚胎阶段始造血系统特异基因表达或缺失的有效工具。Kras基因在白血病中最常见的突变之一为Kras外显子1的由密码子12编码的甘氨酸突变为天冬氨酸,LSL-KrasG12D小鼠则是在该突变的上游包含有一个两端带有loxp的转录终止密码子,可被Cre重组酶切除,从而导致突变的癌性Kras基因(KrasG12D+)的表达。Pten基因的外显子5为编码磷酸酶的结构域,被认为是Pten基因发挥作用的重要结构域。条件性Pten敲除小鼠(Ptenf/f)则是在小鼠Pten基因外显子5的两端插入loxp序列,可被Cre重组酶敲除,从而导致Pten基因的功能缺失。本研究旨在利用LSL-KrasG12D小鼠、Ptenf/f和Vav-iCre小鼠平行建立KrasG12D+表达和Pten-/-这两种胚胎阶段始血液系统非病毒致特异基因突变的小鼠模型,获得KrasG12D+或Pten稳定一致表达或缺失的基因型小鼠,观察其不同表型,探索KrasG12D+表达或Pten-/-对胚胎造血及出生后白血病发生的作用,为深入认识儿童白血病的发生机制及可能的防治工作提供动物实验依据。本研究主要分为以下两个部分：第一部分：Kras G12D+表达对小鼠白血病发生及胚胎造血的影响方法1.将LSL-KrasG12D小鼠与Vav-iCre小鼠杂交,在子鼠21天时分笼编号,取部分耳组织提取DNA,通过PCR方法及基因测序方法鉴定子鼠基因型。2.提前一晚将LSL-KrasG12D母鼠与Vav-iCre小鼠放置于一笼拟交配,于发现母鼠有阴道栓的清晨计为胚胎第0.5日(E0.5),分别于E14.5和E15.5取小鼠胚胎,对比观察组、对照组胚胎形态差异,并对正中矢状面切片固定行HE染色,观察对比胎肝组织学变化；取胎肝细胞行流式细胞学检查,检测细胞表面抗体Ter119、CD71的表达,分析观察组、对照组胎肝细胞红系细胞分化的差异。结果1. LSL-KrasG12D小鼠与Vav-iCre小鼠杂交后,于48只子鼠中,PCR基因型鉴定结果示Kraswt;Vav-Cre-基因型小鼠17只,占35.24%,LSL-KrasG12D基因型小鼠16只,占33.33%,Kraswt;Vav-Cre+基因型小鼠15只,占31.25%,KrasG12D+基因型小鼠(拟观察组)0只,各基因型发生率不符合孟德尔遗传定律。5只LSL-KrasG12D基因型母鼠及15只Vav-Cre+基因型小鼠的KrasG12D基因突变测序结果示5只LSL-KrasG12D基因型母鼠均含有KrasG12D突变,而Vav-Cre+基因型小鼠不含该突变。2.从形态学上与Kraswt；Vav-Cre+基因型小鼠的胎肝相比,E14.5的KrasG12D+基因型小鼠胚胎胎肝颜色苍白,并可伴有点状出血点,E15.5的胚胎则出现脑部或弥漫性出血。E15.5胚胎矢状面切片HE染色示KrasG12D+小鼠胎肝肝叶中央部位细胞轻度减少,远端部位有核红细胞增多,伴有严重的细胞坏死。3.流式细胞学检测E14.5的KrasG12D+基因型小鼠胚胎的新鲜胎肝细胞表面CD71、Ter119的表达结果示Ter119-CD71+细胞群比例为(8.20±4.39)%,较.Kraswt;Vav-Cre+基因型小鼠胚胎的(3.66±0.62)%明显增高,两组相比有显著的统计学意义(P<0.001)。小结1.LSL-KrasG12D小鼠与Vav-iCre小鼠杂交后不能获得成活的KrasG12D+基因型小鼠。2.KrasG12D+基因型小鼠胚胎于E14.5-E15.5因发生脑部出血或弥漫性出血而死亡。3.KrasG12D+基因型小鼠胚胎胎肝中红系原始细胞及祖细胞比率增高。第二部分：Pten表达缺失对小鼠白血病发生及胚胎造血的影响方法1.将Ptenf/f与Vav-iCre小鼠杂交,获得PtenΔ/+;Vav-Cre+基因型(Pten+/-)小鼠,再次与Ptenf/f小鼠杂交,行基因型鉴定,分析不同基因型表达是否符合孟德尔遗传定律。将小鼠分为Pten-/-(PtenΔ/Δ;Vav-Cre+)基因型(观察组)、Pten+/-(PtenΔ/+;Vav-Cre+)基因型(对照组)和Ptenf/f/Ptenf/+基因型(对照组)三组。每日观察小鼠状态,于50天取小鼠外周血行全血细胞计数,观察细胞分类、比例变化。于观察组小鼠病重时对小鼠行安乐死,取外周血细胞行细胞离心涂片、Giemsa染色,取脾脏、肝脏、胸腺组织固定、HE染色,观察细胞形态,分析肿瘤类型,对骨髓细胞或胸腺细胞行流式细胞学检查,检测其细胞表面抗体CD19、Thy1、CD45、CD4、CD8等表达,进一步分析肿瘤类型,同时对照组小鼠做相同处理,分析观察组小鼠和对照组小鼠生存曲线的差异。2.小鼠骨髓细胞移植实验：取4×106Pten-／-基因型小鼠的胸腺细胞或骨髓细胞(CD45.2),通过小鼠尾静脉注射入6-8周龄的亚致死量照射(650cGy)的移植受体C57BL/6J (CD45.1/CD45.2)小鼠,每日观察小鼠状态,于小鼠病重时对小鼠行安乐死,提取新鲜的骨髓或脾脏细胞,通过流式细胞学检测CD45.1、 CD45.2及CD3、CD4、CD8表达,CD45.1-CD45.2+细胞群为植入细胞,含有2.5%以上的CD45.1-CD45.2+细胞认为是有效移植。3.提前一晚将Pten+/-母鼠与Vav-iCre小鼠放置于一笼拟交配,于发现母鼠有阴道栓的清晨计为胚胎第0.5日(E0.5),于E14.5取小鼠胚胎,行基因型鉴定,观察胚胎形态有无差异,并对胎肝细胞行流式细胞学检查,检测细胞表面抗体,分析观察组、对照组胎肝造血祖细胞组成成分比例的差异。结果1. Ptenf/f小鼠与Vav-iCre小鼠杂交后,获得50%Pten+/基因型小鼠,将6只Pten+/-小鼠分别与Vav-iCre小鼠杂交后,于61只子鼠中,PCR基因型鉴定结果示Pten-/-基因型小鼠13只(观察组),占21.31%,Pten+/-基因型小鼠17只,占27.87%, Ptenf/f基因型小鼠15只,占25.00%,Ptenf/+基因型小鼠16只,占26.23%,各基因型发生率符合孟德尔遗传定律。Pten-/-基因型小鼠中位生存时间为82天,而Pten+/-基因型小鼠的中位生存时间大于200天,两组相比其差异具有显著性统计学意义(P<0.001)。2.于50天取小鼠外周血行全血细胞计数,结果显示Pten-/-基因型小鼠白细胞数量较Pten+/基因型小鼠明显增高,具有显著统计学意义(P<0.05)。3.从形态学上与Pten+/-基因型小鼠相比,Pten-/-基因型小鼠出现弓背、呼吸抑制及体重减轻,解剖学检查结果示胸腺、脾脏和肝脏体积增大、重量增加(P<0.05)。4.与Pten+/-基因型小鼠相比,Pten-/-基因型小鼠胸腺HE染色示胸腺出现淋巴母细胞浸润,正常组织结构消失；脾脏、肝脏切片HE染色示脾脏、肝脏出现白血病细胞浸润,正常组织结构破坏；外周血细胞离心涂片Giemsa染色示外周血中出现原始淋巴细胞浸润。5.应用流式细胞学检测胸腺细胞表面抗体CD19(B细胞)和Thy1(T细胞)的表达,结果示其主要为CD19-Thy+((80.2±2.7)%),而后检测CD45+的胸腺细胞群表面抗体CD4和CD8表达,结果示3只小鼠胸腺肿瘤细胞为CD4+CD8+(1/2),1只为CD8+CD4-(1/6),另外两只为CD4+CD8-(1/3).6.小鼠的骨髓细胞移植实验结果示4×106的Pten-/-基因型小鼠胸腺细胞或骨髓细胞经静脉注射入移植受体C57BL/6J(CD45.1/CD45.2)小鼠后,于2-16周受体小鼠发病,表现基本同Pten-/-小鼠,流式细胞学检测骨髓细胞中CD45.1-CD45.2+细胞群均>5%((24.4+3.1)%),且该群细胞群表面抗体CD3+。7.应用流式细胞学检测小鼠胚胎胎肝细胞表面的lin、Scal-1、c-kit、CD34和FcRⅡ/Ⅲ等抗体表达,结果示与Pten++/-基因型小鼠相比,Pten-/-基因型小鼠胚胎胎肝细胞中富含造血干细胞的LSK (lin-Scal-l+c-kit+)细胞群无明显变化,而造血祖细胞(HPC)中的共同髓系祖细胞群(CMP)增高,共同淋系祖细胞群(CLP)减少,两组差异具有显著性统计学意义(P<0.05,P<0.01)。小结1. Ptenf/f小鼠与Vav-iCre小鼠杂交后,成功获得长期正常生存的Pten+/-基因型小鼠。Pten+/-基因型小鼠与Ptenf/f小鼠杂交后,成功获得可存活的Pten-/-基因型小鼠。Pten-/-基因型小鼠中位生存时间较Pten+/-基因型小鼠的中位生存时间明显缩短。2. Pten-/基因型小鼠发生肝脾肿大、胸腺增大,细胞形态学及流式细胞学显示急性T淋巴细胞白血病/淋巴瘤(T-ALL/L)特性。3. Pten-/-基因型小鼠发生的T-ALL/L具有可移植性。4. Pten-/-基因型小鼠的胚胎胎肝造血祖细胞中CMP增高,而CLP减少。结论1.利用Vav-iCre转基因小鼠诱导KrasG12D+在发育阶段表达的KrasG12D+基因型小鼠于E14.5-E15.5死亡,提示该小鼠模型不能用于解释说明胚胎期KrasG12D+表达可导致出生后白血病发生这一问题。2.胚胎期KrasG12D表达阻碍小鼠胎肝红系祖细胞向成熟红细胞的分化,导致KrasG12D+小鼠胚胎出现贫血。3.胚胎期始Pten基因的单倍缺失不影响小鼠的表型,而Pten-/-小鼠发生可移植的T-ALL/L。4.胚胎期Pten表达缺失除了在祖细胞水平引起淋系和髓系的交错变化外,对总的胚胎造血无明显影响。