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背景与目的动脉瘤性蛛网膜下腔出血(a SAH)是一种严重危害人类健康的出血性脑血管疾病。脑血管痉挛(CVS)曾被认为是迟发性缺血性神经功能障碍(DIND)发生发展的主要机制,但是不断改进的脑血管痉挛(CVS)防治措施,并没有获得迟发性缺血性神经功能障碍(DIND)预后的显著改善,a SAH的致残率和病死率仍高。近年来,早期脑损伤(EBI)的理念受到越来越多人认可,认为动脉瘤破裂时,颅内压(ICP)急剧上升伴随脑灌注压(CPP)降低引起全脑及脑血管的病理生理损害即EBI对预后起决定性影响。对EBI机制的研究刚开始,尚缺乏简单、易得、可控性强、能很好模拟人类a SAH后EBI的动物模型,也缺乏有效的脑保护剂。研究发现脑红蛋白(Ngb)在正常神经元中表达,脑缺血、缺氧、脑外伤时表达增高,有脑保护作用,但在aSAH后EBI中尚鲜有报道。本课题拟新建一种更符合颅内动脉瘤破裂a SAH引起颅压急剧升高EBI病理生理过程的动物模型;在mRNA转录及蛋白表达水平检测aSAH后EBI不同时间点脑组织中Ngb变化;利用原核生物表达系统,制备融合蛋白TAT-Ngb及Ngb;观察外源性TAT-Ngb能否透过血脑屏障进入神经元内及对aSAH后EBI是否具有脑保护作用,并探讨其可能的作用机制。方法1、手术显微镜下对新西兰白兔行右额顶部开颅,置入颅内压探头于颅前窝,置入分流管于鞍上池蛛网膜下腔;穿刺粗大的耳正中动脉,将动脉血分流入颅内;监测动脉血流冲入蛛网膜下腔时颅内压(ICP)、脑灌注压(CPP)、有创动脉血压、心率等生理参数变化;24h后按S.Endo法行神经功能评分,处死动物,取脑制石蜡切片,行HE染色、尼氏染色及TUNEL染色并观察。2、随机分成假手术对照组及造a SAH模型3h、6h、12h、24h、48h及72h共7组,取脑,RT-PCR和Western blotting检测aSAH后EBI兔脑组织中Ngbm RNA转录及蛋白表达,并行免疫组化。3、利用DH5α菌扩增、抽提p ET28b-TAT-Human Ngb和pET28b-Human Ngb原核表达质粒,将其转入BL21(DE3)菌内,诱导表达融合蛋白TAT-Ngb及Ngb;破碎细菌,提取可溶性上清液中的蛋白;Ni-NTA Resin亲和层析柱分离纯化蛋白,PD-10脱盐柱脱盐,Western Blotting鉴定融合蛋白TAT-Ngb及Ngb的特异性。4、经兔耳缘静脉注射融合蛋白TAT-Ngb或Ngb,4h后处死,取脑冰冻切片,用NSE单克隆抗体和6x His单克隆抗体行免疫荧光双标染色并观察。5、随机分成TAT-Ngb治疗组、Ngb对照组及NS对照组3组。造兔a SAH模型,即予相应药物耳缘静脉注射,于6h和72h后按S.Endo法行神经功能评分,随后处死,取脑制石蜡切片,HE染色、尼氏染色及TUNEL染色并观察。分别行Western blotting检测兔脑组织bcl-2、bax、caspase-3及caspase-9蛋白表达。结果1、成功地建立了耳动脉-颅内分流的兔aSAH模型。该模型有颅内压(ICP)急剧升高、脑灌注压(CPP)下降和神经功能恶化。病理染色显示模型组有脑损害,假手术组无脑损害。2、正常兔脑组织有较弱的Ngb mRNA转录及蛋白表达。aSAH后,3h组Ngb转录水平稍上调但与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05),蛋白表达未见上调;6 h组Ngb转录水平稍增高,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01),表达水平稍增高,与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05);12 h组Ngb转录及表达水平均增高,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01);24 h组Ngb转录和表达水平均达到高峰(与对照组比较,P<0.01);48 h组Ngb转录和表达水平开始下降(与对照组比较,P<0.01);72h组Ngb转录和表达水平均下降,但仍高于正常对照组(P<0.01);免疫组化显示Ngb位于胞浆中,染色程度也呈相应改变。3、扩增了p ET28b-TAT-human Ngb或p ET28b-human Ngb质粒,导入BL21(DE3)菌中表达了大量可溶性蛋白,提取、纯化、脱盐,经Western Blotting证实获得含6x His的融合蛋白TAT-Ngb、Ngb。4、经NSE单克隆抗体和6x His-tag单克隆抗体的免疫荧光双标证实,静脉注射TAT-Ngb融合蛋白在4h内能通过血脑屏障及细胞膜,进入神经元胞浆中,而Ngb不能。5、与对照组比较,TAT-Ngb融合蛋白治疗a SAH后EBI,改善实验兔神经功能评分,差异有统计学意义(P<0.01);增加神经元内尼氏体颗粒,减少细胞凋亡,改善组织病理学损害。TAT-Ngb治疗组bcl-2表达上调,Bax、caspase-9及caspase-3的表达下调,与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.01)。结论1、本研究建立的兔耳动脉-颅内分流兔a SAH模型能模拟人类a SAH后EBI,具有操作可控、副损伤小、死亡率低、实验动物来源广且价廉的优点。2、兔a SAH后EBI能上调脑神经元Ngb基因转录及蛋白表达水平,且随发病时间呈规律性变化。3、TAT-PTD能介导Ngb透过血脑屏障进入兔脑组织神经元胞浆内。4、TAT-Ngb治疗能改善兔aSAH后EBI,其脑保护作用与减轻线粒体途径细胞凋亡有关。