目的:对乳猪窦房结的所在部位进行准确的定位,建立一套可靠的窦房结细胞取材、分离、纯化培养技术。在成功培养乳猪窦房结细胞的基础上选取窦房结细胞作为种子细胞,以胶原纤维膜为支架材料进行复合培养,在体外构建组织工程窦房结的雏形。方法:（1）窦房结细胞的取材:取出生24h内乳猪5只,氯胺酮（ketamine, 10mg/kg）麻醉,依次用酒精、碘伏消毒胸腹部皮肤、沿胸骨正中切开皮肤,剪开胸骨,并用乳突牵开器牵开,再用眼科剪分离心包膜、胸腺,暴露整个心脏至上腔静脉。轻牵移右心耳,看清上腔静脉,用多导电生理记录仪的2根双极电极在窦房结区域（上腔静脉与右心房交界处周围）用蛙跳方式反复标测记录电活动,寻找房波最早出现的位置。在该位置插入银针一枚,取下整个心脏,然后在解剖显微镜下围绕银针周围取1.5mm×1.5mm×1mm的组织块放入PBS（0.01mmol/L）中。将所取乳猪的窦房结组织进行原代细胞培养,随机分两组:常规方法培养和纯化培养。（2）心房肌细胞的取材:在解剖显微镜下,在取下的整个心脏的左心房部位取1.5mm×1.5mm×1mm的组织块放入PBS （0.01mmol/L）中。（3）窦房结细胞纯化培养:将组织块用PBS液洗涤3次以后剪碎;加入0.25%胰酶和0.1%胶原酶Ⅱ各2ml,放入孵箱孵育15min,弃上清液;加入0.25%胰酶和0.1%胶原酶Ⅱ各2ml后置于37℃水浴中振荡15min,再吹打l²min,自然沉淀1²min;吸取细胞悬液移入另一支离心管中,加等体积含20%胎牛血清的DMEM培养基终止胰酶消化。重复消化5次至组织块基本消化成单细胞为止;将收集的细胞悬液离心（1500转/min）,弃上清液;再用含20%胎牛血清的DMEM培养基洗细胞一次,离心,弃上清液;加入含20%胎牛血清的DMEM完全培养基（含青霉素100IU/ml,链霉素100μg/ml）,打散细胞团为单细胞悬液;调整细胞数为1×10⁵个/ml,将单细胞悬液接种于一次性培养瓶中置于37℃、5%CO₂孵箱中培养90min后,采用差速贴壁分离技术,吸收培养瓶中的细胞悬液,收集至一次性培养皿中,调整5’-bromodeoxyuridine （5-BrdU）浓度为0.1mmol/L放入孵箱培养;每天用含0.1mmol/L 5-BrdU的含20%胎牛血清