论文部分内容阅读
目的:研究观察不同浓度的地塞米松（DEX）在不同的作用时间下对成骨细胞凋亡的影响,探讨成骨细胞凋亡在糖皮质激素性骨质疏松症中可能的作用机制。方法:采用酶消化法对SD新生大鼠颅骨的成骨细胞进行分离培养,采用细胞形态学观察、茜素红染色观察钙结节形成、碱性磷酸酶染色等方法进行成骨细胞鉴定。取第三代细胞进行实验,分别用0M、5*10-5M、5*10-6M、5*10-7M、5*10-8M DEX干预成骨细胞12h,24h,48h。用cck8法检测不同浓度的DEX干预不同时间后成骨细胞的存活率,Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测成骨细胞的凋亡率,实时荧光定量PCR检测骨形成指标碱性磷酸酶和I型胶原,凋亡指标caspase-3、caspase-9基因的表达情况。Western blotting检测凋亡指标caspase-3蛋白的表达情况。结果:1.采用酶消化法提取的原代成骨细胞形态呈长梭形、三角形、不规则多边形,有2-3个细胞突起,碱性磷酸酶染色呈蓝黑色,茜素红矿化结节染色呈橙红色,呈现出典型的成骨细胞特点。2.cck8结果显示:与对照组相比,随着DEX浓度的增加,DEX对成骨细胞增殖的抑制作用逐渐增强,以5*10-5M DEX的抑制作用最强,提示DEX对成骨细胞增殖的抑制作用呈浓度依赖性。3.Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术结果显示:不同浓度的DEX均促进成骨细胞的凋亡,DEX促进成骨细胞凋亡作用随着药物浓度的增加而增强,呈浓度依赖性;同时随着干预时间的延长,成骨细胞的凋亡率也逐渐增强,呈时间依赖性。4.PCR结果显示:不同浓度的DEX可引起骨形成指标碱性磷酸酶和I型胶原的基因表达减少,成骨细胞凋亡指标caspase-3和caspase-9的基因表达增加,呈现出浓度依赖性和时间依赖性。5.Western blotting结果显示:不同浓度的DEX干预成骨细胞24h后,能促进凋亡指标caspase-3蛋白表达,呈现出浓度依赖性。结论:地塞米松可能通过诱导成骨细胞凋亡,抑制骨形成,参与了糖皮质激素性骨质疏松症的发生。