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研究背景与目的:PRKAG2基因突变可导致心脏功能紊乱,典型特征是:心室预激、进展性心脏传导功能障碍、心脏肥厚,以及心肌细胞糖原过量沉积,被定义为PRKAG2心脏综合征,属于糖原累积性心肌病,少数病人可出现骨骼肌异常等心脏外病变。该病虽类似肥厚性心肌病,但与之不同的是,PRKAG2心脏综合征无肌节排列紊乱,无或少量心肌纤维化。PRKAG2心脏综合征虽然罕见,但经家系分析显示呈常染色体显性遗传,在受累家系中病患并不少见。目前,国内外报道的PRKAG2基因突变至少有16种,含1种移码突变和15种错义突变;绝大多数研究认为正是这些突变导致腺苷单磷酸活化蛋白激酶（AMPK）活性改变从而引发了各种临床病症。不同的突变位点导致的临床表型轻重不一,而即使是同一突变,家系成员的临床表现也各有差别。由于心脏取材受限,既往大部分的研究都采用转基因或基因敲入小鼠作为实验对象,但由于存在种属差异,研究结果备受质疑。尤其关于PRKAG2基因突变引起AMPK活性改变,一直存在升高和降低两方面的争议。随着人诱导干细胞技术的日益成熟,人们可以将病人的体细胞重编程为干细胞,再分化为心肌细胞,用于疾病的机制研究;这不仅规避了种属差异的局限,也克服了临床取材的难题,并能为实验研究提供足量的标本。2007年,张静等报道了一个家族性传导异常伴心室预激及心肌肥厚的家系;通过基因测序,发现PRKAG2基因外显子3上（cDNA298位点）的碱基尿嘌呤G被腺嘌呤A代替,导致编码的氨基酸（100位点）甘氨酸Gly被丝氨酸Ser代替,引起了PRKAG2心脏综合征。虽然研究者相继在CCL13细胞、斑马鱼及小鼠模型对该病的发病机制进行了更深入的研究,但均不能真实体现病患心肌细胞的状态。结合当前兴起的诱导干细胞技术,我们试图从病患层面对该病进行研究。目前关于PRKAG2心脏综合征的诱导干细胞模型的研究较少,该病具体的发病机制尚不清楚;描述该病心肌细胞糖原含量、AMPK活性、AMPKγ2表达量、细胞大小及心肌细胞功能等特征指标的研究尚不全面。本研究的目的为:建立PRKAG2心脏综合征病患源诱导性多能干细胞定向分化心肌细胞,并进行相关的特征检测。研究方法:（1）PRKAG2心脏综合征家系临床资料收集及基因检测:共入选9人,其中家系成员6人,成员配偶3人。并采集病史、血液及尿液标本,行体格检查及辅助检查（包括心肌酶、心电图、心脏彩超、动态心电图等）;提取DNA,利用多聚酶链式反应（PCR）扩增PRKAG2基因外显子3行基因测序,依此结果并结合临床表现分组,各组选1名组员的外周静脉血做全外显子组测序;（2）诱导性多能干细胞的培养及心肌细胞定向分化:分离外周静脉血获得外周血单核细胞或分离尿液获得尿液脱落细胞,并扩增细胞;选用Epi5附加体iPSC重组试剂盒,采用基因非整合无饲养层培养技术,将体细胞诱导、培养为多能干细胞（iPSCs）,并对其进行验证。随后,采用小分子化合物分化法将iPSCs定向分化为心肌细胞（CMs）,并对CMs进行鉴定;（3）病患源iPSC-CMs的特征检测:对培养时间为30-90天的iPSC-CMs,通过过碘酸-雪夫（PAS）染色试剂盒定性分析细胞中的糖原含量。利用细胞免疫荧光染色,计算心肌细胞特异性表达抗体TNT或α-actinin呈阳性的iPSC-CMs表面积,统计分析各组细胞大小。采用Western blotting检测各组样品中AMPKα、p-AMPKα、AMPKγ2的含量,AMPK活性由p-AMPKα与AMPKα比值获得。采用全细胞膜片钳技术检测心肌细胞的动作电位和离子通道电流。研究结果:（1）经全外显子检测,在Ⅲ-3的PRKAG2基因中发现2个突变位点,导致编码的氨基酸发生改变,分别为R302Q和G100S。综合病史、辅助检查及外显子3基因测序,可分为三组:病患组、家系健康组和非家系健康组。病患组包括4名家系成员Ⅱ-1、Ⅲ-2、Ⅲ-3和Ⅳ-2。该组基因检测证实存在PRKAG2基因突变。除Ⅳ-2外,均有不适症状,如胸闷、心慌等;心脏彩超发现心肌肥厚,或心电图提示房颤、心动过缓、束支传导阻滞等心律失常。Ⅳ-2属于该组中较特殊者,心电图提示窦性心动过缓,基因检测有突变基因,但患者目前无不适症状,心脏彩超未见异常。家系健康组包括2名家系成员Ⅲ-1、Ⅳ-3,无明显不适症状,辅助检查未见明显异常,且基因检测也无基因突变。非家系健康组包含3名成员配偶,未见明显异常发现;（2）有5名入选者的体细胞成功诱导为iPSCs,为病患组Ⅲ-2、Ⅲ-3,家系健康组Ⅳ-3,非家系健康组Ⅲ-2妻、Ⅲ-3妻,iPSCs多能性鉴定结果为:碱性磷酸酶染色呈阳性,细胞免疫荧光染色显示细胞表面多能性标记Oct-4、Sox-2、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81、Nanog均呈阳性,实时荧光定量PCR显示多能性相关基因Nanog、REX1、ESG1、DPPA2、UTF1表达均增高。iPSCs均能定向分化为CMs,并通过显微镜下观察到的细胞自发性搏动,以及细胞免疫荧光染色心肌特异性蛋白TNI、TNT、α-actinin呈阳性,得以证实;（3）病患源iPSC-CMs特征检测:PAS染色显示,三组iPSC-CMs糖原未见明显差异,表明病患组iPSC-CMs无明显糖原沉积。细胞免疫荧光染色表明,病患组iPSC-CMs面积（514.1±288.2μm2）大于家系健康组（325.0±289.2μm2,P<0.05）和非家系健康组iPSC-CMs（283.6±233.4μm2,P<0.05）;证实病患组iPSC-CMs细胞增大。Western blotting结果显示,病患组和非家系健康组iPSC-CMs的AMPK活性未见明显差异（0.94624±0.06390和0.85370±0.03645,P=0.08）,但均高于家系健康组（0.73588±0.12625,P<0.05）;表明病患组iPSC-CMs的AMPK活性无明显改变。病患组AMPKγ2含量高于2健康组,表明突变的基因导致了目标蛋白表达增加。细胞膜片钳检测记录到类似心室肌、心房肌动作电位,并观察到病患组iPSC-CMs存在高钠、高钙通道电流（1500-2000pA）,而家系健康组iPSC-CMs未观察到该现象。研究结论:本课题成功地将PRKAG2心脏综合征（突变位点为R302Q合并G100S）病患体细胞诱导为多能干细胞并最终定向分化为心肌细胞;证实了病患源iPSC-CMs具有PRKAG2心脏综合征部分特征,如细胞增大、AMPKγ2表达增多、钠钙通道电流异常;但未见明显糖原沉积,AMPK活性无明显改变。本课题iPSC-CMs检测量仍偏少;完善分化和培养条件以获得足量的相对成熟的iPSC-CMs是后期研究需要解决的难题。总之,本课题诱导分化的iPSC-CMs可以作为后续研究PRKAG2心脏综合征发病机制的一种有效模型。