器官移植作为上世纪的重大医学突破之一,挽救了数以万计的生命,已经成为器官衰竭患者唯一有效的治疗手段。随着上世纪70年代后免疫抑制剂的出现,细胞介导的排斥反应得到有效控制,移植物的存活期得以显著延长。但移植排斥反应并未完全得到解决,移植排斥导致的移植物失功依然是困扰免疫学家的难题。移植排斥是机体免疫系统针对同种移植抗原刺激后多种免疫细胞和多类型免疫应答反应的综合结果。免疫排斥机制极其复杂,不仅涉及移植抗原诱导的获得性免疫,还涉及缺血再灌注损伤诱发的先天性免疫;不仅与移植抗原激活的CD4+T、CD8+T细胞介导的细胞免疫有关,还与同种特异性抗体介导的体液性免疫应答密不可分。此外,在移植排斥反应的过程中,不同类型的免疫反应同时或者前后发生,相互交织。因此,虽然免疫学的快速发展为我们认识移植排斥产生的机制提供了基础,但目前我们对于移植排斥的发生机制、耐受机制以及调控网络的认识仍较为有限。近年来,大量microRNA的研究表明其在免疫细胞发育、免疫应答以及免疫耐受等免疫学方方面面均起到了关键性调控作用。但microRNA与移植免疫的研究依然为数不多,且绝大部分研究是将microRNA作为移植排斥的诊断指标。实体器官移植的基础研究仅涉及miR-155、miR-17-92等少数几个microRNA。因此,进一步研究microRNA调控移植排斥的机制有助于丰富我们对于移植排斥发生机制、耐受机制以及免疫调控网络的认识。前期,本研究所其它人员研究发现:miR-29能够直接靶向干扰素γ。低表达miR-29的转基因小鼠血清中高表达干扰素γ,能有效抵抗李斯特菌感染。然而,我们组进行同种异基因移植时却惊奇发现:低表达miR-29的转基因小鼠的移植物生存时间显著延长至2周以上。IFN-γ作为Th1细胞（细胞介导的排斥反应最主要的效应细胞）的主要效应因子,高表达IFN-γ往往视作Th1反应性增强,移植排斥反应理应增强。但为何低表达miR-29后却能够显著延长移植物存活期?miR-29又是通过什么机制在移植排斥中发挥如此显著的作用?是否miR-29其它的靶基因在移植排斥中起到了关键作用?基于这些问题,我们对miR-29调控移植排斥的机制进行了研究。第一部分:低表达miR-29显著抑制同种异基因移植排斥反应。首先,我们运用sponge技术构建了低表达miR-29的转基因小鼠GS29。选用GS29小鼠作为受体,BALB/c小鼠作为供体,采用改良的Cuff技术进行小鼠颈部异位心脏移植,观察低表达miR-29对移植排斥的影响。发现与对照组相比,GS29小鼠组移植物存活时间显著延长,同时移植心脏、外周免疫器官肿胀程度以及血栓情况显著轻于对照组。此外,对移植第5天的受体小鼠运用流式检测细胞亚群发现:与对照组相比,GS29小鼠组引流淋巴结和脾脏中B细胞比例明显减少,T细胞（CD3+）比例上升。进一步检测T细胞亚群发现:与对照组相比,GS29小鼠组引流淋巴结和脾脏中CD8+T细胞比例上升,CD4+T比例明显减少。同时我们发现,与T细胞相比,B细胞无论是比例和数量的减少均更为显著。进一步,我们对受体小鼠脾脏中Th1细胞以及受体小鼠脾脏和淋巴结中的Treg细胞进行分析发现:两组小鼠外周免疫器官中的Treg细胞和Th1细胞无明显差异。HE染色发现:GS29小鼠组移植物中免疫细胞浸润明显减少。进一步组化实验证实:与对照组相比,GS29小鼠组移植物中CD4+、CD8+以及CD138+的表达显著减少。综上结果,提示我们低表达miR-29显著抑制同种异基因移植排斥反应的作用可能主要与其同时抑制细胞介导的排斥和抗体介导的排斥反应有关。同时我们的结果显示,低表达miR-29可能对抗体介导的排斥反应的影响更为明显。基于抗体介导的排斥反应已经成为影响移植物失功的最重要因素。故而我们在后续的研究中重点关注抗体介导的排斥反应。第二部分:miR-29影响B细胞AICD调控体液免疫此部分,我们首先检测了静息情况下GS29小鼠体内各B细胞亚群情况。首先我们发现GS29小鼠pro-B到PreB、immature B cell到mature B cell生长发育受阻。GS29小鼠腹腔中B1细胞亚群无明显变化,而脾脏中滤泡B细胞（Fo-B）亚群比例明显减少。进一步,我们运用经典的NP偶联抗原免疫的方法,腹腔注射TI抗原NP-LPS以及TD抗原NP-KLH,分别研究了GS29小鼠TI和TD免疫应答情况,结果显示GS29小鼠TD反应弱于对照组,而TI反应无明显差异。进一步,我们参照以往的文献报道,检测了GS29小鼠生成DSA的能力,发现其亦低于对照组。同种抗原被B细胞识别后,需要在Tfh细胞的辅助下在外周免疫器官中生成生发中心,经历体细胞超频突变、免疫球蛋白类别转化,亲和力得以成熟,最终分化、增殖为特异性的浆细胞。我们流式检测了同种异基因移植2周后GS29脾脏中生发中心B细胞以及Tfh细胞。发现同种异基因移植以后,GS29脾脏中生发中心B细胞明显减少,但Tfh细胞并无明显差异。同时,组化结果显示抗体介导的排斥反应（AMR）的两个特异性指标（IgG和C4d）在GS29组小鼠移植物中表达均下调,提示GS29组小鼠组AMR明显轻于对照组。这些实验证实:同种异基因移植情况下,GS29小鼠是由于B细胞生发中心形成减少而发挥抗AMR的作用。为了研究同种异基因移植情况下GS29小鼠B细胞生发中心减少的机制,首先我们检测了两组小鼠脾脏B细胞活化和增殖的情况,发现LPS刺激后两组小鼠脾脏B细胞增殖能力并无明显差异,同时CD86和MHC II的表达亦无明显差异。而后,我们进一步检测了B细胞活化诱导的细胞死亡（Activation Induced Cell Death,AICD）。我们分选了GS29小鼠脾脏中CD43-B细胞,体外以anti-IgM刺激10小时,流式检测B细胞的AICD情况。实验结果显示,GS29小鼠B细胞AICD明显强于对照组。这与同种异基因移植后移植物tunel组化染色结果相一致。从而,我们认为低表达miR-29影响B细胞生发中心形成可能是B细胞AICD增强的结果。第三部分:miR-29直接靶向PTEN影响PI3K/AKT通路调控B细胞AICD前面的实验,我们在转基因小鼠GS29来源的na?ve B细胞上证实了低表达miR-29能够促进B细胞的AICD。但原代B细胞体外难于存活,后续实验难于展开。故而我们先选用了公认的B细胞AICD体外模型,即体外以羊抗鼠anti-IgM刺激WEHI-231细胞诱导AICD。转染microRNA-29a/b/c的mimics后WEHI-231细胞的AICD明显降低,而转染inhibitor后WEHI-231细胞的AICD明显增强。这些实验再次证明了miR-29能够有效调控B细胞的AICD。进一步,我们对targetscan网站提供的miR-29的1000多个靶点进行GO分析,发现这些靶点中有85个靶点涉及细胞存活与生长发育。再对这85个基因,进行keggpathway富集分析,选取选取couts比较高的四个pathway进行vanny分析,筛选出两个具有广泛作用的两个分子:PTEN与PIK3CA。而后,我们构建了PTEN、PIK3CA以及它们突变体的报告基因用于双荧光报告基因实验,验证靶点。结果显示,miR-29能够直接靶向PTEN,抑制PTEN 3’UTR报告基因的活性。而对于PIK3CA的靶点验证未能得到证实。后续我们构建了PTEN的质粒和siRNA,分别进行过表达和干扰实验,进一步验证miR-29可通过PTEN调控WEHI-231细胞的AICD。PTEN（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten）基因一方面是个明星抑癌基因,另一方面其带有双重特异性磷酸酶,能够使PIP3（phosphatidylinositol-3,4,5-triphosphate,PIP3）脱磷酸化,最终抑制PI3K/AKT通路。而B细胞的AICD主要涉及三种信号,PLCγ,Ras和PI3K/AKT。故而,我们western蛋白印迹法检测了antagomir-29a-3p处理的WEHI-231细胞中p-AKT水平,发现p-AKT水平明显低于对照组。这一实验证实mir-29通过靶向PTEN影响PI3K/AKT通路。进一步研究,我们发现p-BAD水平明显降低;抗凋亡分子Bcl-2和Bcl-xl水平亦降低。以上结果显示,mir-29通过靶向PTEN抑制PI3K/AKT信号通路,导致AKT磷酸化水平降低,影响下游抗凋亡分子Bcl-2和Bcl-xl的表达,最终增强B细胞的AICD。第四部分:核酸药物antagomiR-29可作为药物干预治疗异基因急性移植排斥反应。antagomiR-29是胆固醇修饰的miR-29体内抑制剂,能够特异性抑制体内miR-29的表达,往往能够作为一种核酸药物来干预各种疾病模型。为了明确antagomiR-29能否作为作为药物干预治疗同种排斥反应,我们交由广州锐博生物科技有限公司合成了antagomiR-29a-3p,尾静脉注射的方式干预同种移植排斥反应。实验结果显示,同种异基因移植后注射antagomiR-29a-3p可显著降低同种异基因急性排斥反应,移植物生存时间明显长于对照组。综上所述,miR-29能够直接靶向PTEN基因,通过PI3K/AKT信号通路调控B细胞AICD,导致机体受到同种抗原刺激后外周免疫器官中B细胞生发中心生成不足,影响特异性浆细胞以及DSA的产生,最终抑制抗体介导的排斥反应。