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研究背景糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病的常见和严重并发症,20%-40%的糖尿病患者会进展为DN。在西方国家中DN是终末期肾脏病(end stage renal disease,ESRD)的首要原因,也是糖尿病致命的重要原因。在我国,DN患者的发病率也逐年上升,已经成为ESRD的主要病因之一。2010年对中国近10万名成年人流行病学调查结果:中国成年人糖尿病患病率11.6%,患者约1.14亿。糖尿病前期患病率估计为50.1%,患者约4.93亿。以糖尿病肾病患者经过10~20年50%发展至ESRD计算,未来10~20年我国新增糖尿病肾病引发的尿毒症患者1500万,将给国民身心健康和社会经济发展带来沉重负担。而糖尿病肾病的发病是由多因素共同造成的,发病机制仍不清楚,治疗手段也相对局限,目前的临床治疗只能缓解病情进展而无法逆转或根治疾病。因此研究糖尿病肾病的发病机制,寻找新的治疗靶点对于疾病的早期预防和临床治疗具有重要意义,成为临床和科研工作者的重要任务和国家的重大需求。人肾小球内皮细胞(human renal glomerular endothelial cells,HRGEC)作为肾小球固有细胞之一,表面有特殊的窗孔结构和多糖蛋白复合物覆盖,它位于肾小球毛细血管最内侧与基底膜和足细胞共同构成了肾小球的选择滤过屏障,从而在蛋白质等大分子物质的选择滤过中起到重要作用。此外内皮细胞、足细胞和系膜细胞之间可以通过自分泌、旁分泌等途径相互作用。由于它位置的特殊性,极易受到血液中血糖血脂和炎症因子的影响而损伤,因此内皮细胞特殊的结构和功能在糖尿病肾病的发生发展中起到重要作用。microRNAs(miRNAs)是近年发现的长度20bp左右的内源性非编码小RNA,它主要通过与靶基因mRNA的3’非编码区(3’-UTR)相结合,引导沉默复合体从而降解靶基因mRNA或抑制它的翻译,进而调控下游效应因子的表达来影响机体的多种生理病理过程。然而一个miRNA可以调节多个靶基因产生不同的作用,其参与DN的发生发展机制并不明确,仍需更多的研究来探索miRNA与DN发病的关系。已有的研究表明,miR-155参与细胞的分化、增殖、凋亡以及多种生物组织的发育调节过程。本课题组前期开展了糖尿病患者血清miRNA谱检测,发现与健康对照组比较,糖尿病肾病组早期血清miR-150、miR-155-5p、miR-30e及miR-3196水平显著下降,其中miR-155的表达水平在微量蛋白尿组和大量蛋白尿组对比有显著差异(P<0.05),并与DN患者eGFR呈正性相关,与患者的尿蛋白排泄率呈负性相关。基于理论认识和我们的前期工作基础,我们认为miR-155可能与DN的肾小球内皮细胞功能障碍相关。研究目的对高糖培养的人肾小球内皮细胞转染miR-155,通过miR-155过表达、抑制剂抑制miR-155表达来检测miR-155对靶基因ETS-1和下游效应因子的调控作用,以及对肾小球内皮细胞凋亡和炎症反应的影响,研究高糖环境下miR-155在肾小球内皮细胞损伤中的作用机制。研究对象和方法本研究以原代人肾小球内皮细胞为研究对象,分别检测各组细胞在高糖、转染miR-155过表达和抑制剂时的细胞形态、靶基因ETS-1表达产物(ETS-1)、ETS-1下游效应因子VCAM-1和MCP-1的变化以及细胞凋亡的情况。1.检测高糖刺激对内皮细胞炎症因子和细胞凋亡的影响将对数生长期的人肾小球内皮细胞随机分为三组:正常糖组(NG:5.6 mmol/L D-葡萄糖)、高渗组(HM:5.6 mmol/L D-葡萄糖+24.4 mmol/L甘露醇)和高糖组(HG:30 mmol/L D-葡萄糖)。采用蛋白质免疫印迹法(Western blot)分别检测各组ETS-1、VCAM-1、MCP-1和Cleaved caspase-3的蛋白表达量;通过细胞免疫荧光法观察ETS-1、VCAM-1和MCP-1的定位和荧光强度,进而了解高糖刺激对内皮细胞炎症因子和细胞凋亡的影响。2.检测高糖刺激下转染miR-155对ETS-1及内皮细胞炎症因子和细胞凋亡的影响在高糖环境下,通过对人肾小球内皮细胞转染miR-155 mimic和miR-155inhibitor,以改变miR-155的基因表达水平;并设立转染对照组mimic control和inhibitor control。采用Western blot分别检测miR-155的过表达和被抑制时ETS-1以及VCAM-1、MCP-1和Cleaved caspase-3的蛋白表达,通过细胞免疫荧光法观察ETS-1、VCAM-1和MCP-1的定位和荧光强度,进而了解高糖刺激下转染miR-155对ETS-1及内皮细胞炎症因子和细胞凋亡的影响。3.检测高糖刺激下转染ETS-1 siRNA对VCAM-1、MCP-1的调控作用高糖环境下,在人肾小球内皮细胞转染ETS-1 siRNA以下调ETS-1的mRNA表达水平;并设立siRNA转染对照组Scramble RNA。采用Western blot分别检测ETS-1被干扰时VCAM-1、MCP-1的蛋白表达;通过细胞免疫荧光法观察ETS-1、VCAM-1、MCP-1的定位和荧光强度,进而探讨高糖刺激下转染ETS-1 siRNA对VCAM-1、MCP-1的调控作用。研究结果1.高糖刺激时人肾小球内皮细胞损伤明显,Western blot结果表明:炎症相关蛋白ETS-1、VCAM-1、MCP-1表达上调,凋亡相关蛋白Cleaved caspase-3表达增多,差异显著,均具有统计学意义(P<0.05)。细胞免疫荧光表明:高糖刺激时ETS-1、VCAM-1、MCP-1荧光增强,细胞免疫荧光结果与Western blot结果一致,差异显著,有统计学意义(P<0.05)。2.在高糖培养的人肾小球内皮细胞中转染miR-155 mimic、miR-155 inhibitor及相应对照后,Western blot结果表明:miR-155过表达时ETS-1、VCAM-1、MCP-1、Cleaved caspase-3蛋白的表达减少;miR-155被抑制时ETS-1、VCAM-1、MCP-1、Cleaved caspase-3蛋白的表达增多,差异显著,具有统计学意义(P<0.05),转染对照组与高糖对照组之间无明显差异。细胞免疫荧光结果与Western blot结果一致,差异显著,有统计学意义(P<0.05)。3.在高糖培养的人肾小球内皮细胞中转染ETS-1 siRNA及其对照后,Western blot结果表明:ETS-1、VCAM-1、MCP-1蛋白的表达减少,差异显著,具有统计学意义(P<0.05),Scramble RNA组与高糖对照组之间无明显差异。细胞免疫荧光结果与Western blot结果一致,差异显著,有统计学意义(P<0.05)。结论1.高糖刺激下人肾小球内皮细胞炎症因子表达增多,内皮细胞凋亡增加。2.高糖培养的肾小球内皮细胞过表达miR-155时,ETS-1表达减少,miR-155被抑制时ETS-1表达增加。提示:miR-155可能通过负调控ETS-1的表达参与了内皮细胞的损伤。3.高糖刺激下对人肾小球内皮细胞分别转染miR-155 mimic与ETS-1 siRNA时,ETS-1表达与其下游效应因子VCAM-1、MCP-1表达一致,呈正相关。ETS-1可能通过调控VCAM-1、MCP-1从而介导内皮细胞的炎症反应。