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目的: 人类白细胞抗原-G(human leukocyte antigen G,HLA-G)属于非经典HLAI类家族成员,HLA-G分子通过与其相应受体结合,能够直接抑制机体免疫效应细胞的免疫学功能或通过诱导产生调节性T(Treg)细胞等机制参与机体的免疫调节过程,是机体内一个重要的免疫耐受分子,在肿瘤细胞、病毒感染、炎症等免疫逃逸过程中发挥关键作用.HLA-G在肿瘤、自身免疫性疾病和病毒感染等病理条件下均可诱导性表达,异常表达的HLA-G分子与疾病的发生发展和转归有密切联系.本文旨在探究在肝癌中HLA-G通过"trogocytosis"实现细胞间HLA-G的交换,使HLA-G阴性细胞临时获得HLA-G并发挥免疫抑制作用以及肝癌原发性肿瘤组织中sHLA-G表达水平的临床意义,探究HLA-G在肝癌免疫逃逸过程中的作用机制. 方法: 1.HLA-G转染表达及鉴定 将HLA-G/pVITR02-mcs及阴性对照pVITR02-mcs转染到人肝癌细胞株HepG2、人小细胞肺癌细胞株NCI-H446、人绒毛膜癌细胞株JAR、人慢性髓系白血病细胞株K562、人卵巢癌细胞株H0-8910,并采用流式细胞术、蛋白质免疫印迹方法鉴定转染细胞中HLA-G的表达情况. 2.肝癌细胞通过"trogocytosis"获取HLA-G1的检测 建立稳定表达HLA-G1抗原的HepG2、K562、JAR、NCI-H446、H0-8910细胞株作为供体细胞,经亲脂性染料PKH67对其染色后与受体细胞HepG2细胞共培养,通过流式细胞术及荧光显微镜技术检测HepG2细胞获取供体细胞的HLA-G1的情况,探究HLA-G通过"trogocytosis"实现免疫逃逸的机制. 3.肝癌患者肿瘤组织中sHLA-G表达水平检测 收集80例肝癌患者肿瘤组织,应用免疫组织化学法(IHC)检测组织sHLA-G分子表达水平,探究sHLA-G表达水平对肝癌患者的生存结局的影响及其预后价值. 结果: 1.HLA-G转染表达及鉴定 经流式细胞术分析显示HLA-G抗原能在HepG2-HLA-G1、K562-HLA-G1、NCI-H446-HLA-G1、H0-8910-HLA-G1、JAR-HLA-G1细胞株表面表达,westernblot结果显示HLA-G/pVITR02-mcs重组质粒成功转染HLA-G表达阴性的人肝癌HepG2细胞株、人小细胞肺癌NCI-H446细胞株、人绒毛膜癌JAR细胞株、人慢性髓系白血病K562细胞株、人卵巢癌H0-8910细胞株,即以上细胞株转染成功. 2.肝癌细胞通过"trogocytosis"获取HLA-G1的检测 HepG2细胞能够通过细胞间的相互接触同源获取HepG2-HLA-G1细胞、异源获取K562-HLA-G1、NCI-H446-HLA-G1、H0-8910-HLA-G1、JAR-HLA-G1细胞表面的HLA-G1,即"trogocytosis",证实其可通过此方式实现免疫逃逸. 3.肝癌患者肿瘤组织sHLA-G表达水平检测 本研究将肿瘤组织sHLA-G表达水平高于5%时判定为阳性.肝癌患者原发肿瘤组织36.3%(29/80)可检测到sHLA-G分子表达阳性.分析结果显示,肝癌组织sHLA-G分子表达与患者年龄相关p=0.015);肝癌组织sHLA-G表达水平与患者生存结局不相关(p=0.200),但多变量Cox比例风险回归模型分析提示其可作为肝癌患者的独立预后因子(HR=2.419,p=0.023).肝癌患者临床参数分层状态下分别对sHLA-G≤5%组和sHLA-G>5%组肝癌患者进行生存分析,数据分析显示sHLA-G表达水平高于5%的患者与低于5%的患者相比生存时间缩短,因此sHLA-G对肝癌患者的生存结局有一定的预测价值. 结论: 表达HLA-G1的肝癌细胞可通过"trogocytosis"机制使更多的HepG2细胞获得HLA-G从而可以使肿瘤细胞共享免疫逃逸方式.因此,"trogocytosis"可作为肝癌细胞实现免疫逃逸的机制之一.同时,研究发现肝癌原发性肿瘤组织有sHLA-G表达,证实肝癌组织中sHLA-G可能也参与了免疫逃逸.