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目的:通过体外加入骨向诱导液进行培养,观察比较犬骨髓间充质干细胞(bone marrow stromal cells, BMSCs)和牙周膜基质干细胞(periodontal ligament stem cells, PDLSCs)的形态特征及两者在体外成骨能力的差异;再分别与支架材料β-磷酸三钙(β-TCP)复合并植入裸鼠皮下后,探索拉布拉多犬 BMSCs和拉布拉多犬PDLSCs异位成骨能力的差异。 方法:(1)犬BMSCs的培养:成年拉布拉多犬一只,将犬髂后上棘去毛后消毒,铺巾,待麻醉起效后,用骨髓穿刺针于犬髂后上棘穿刺抽取骨髓于离心管中,低速离心后将其接种于培养皿中,加入DMEM。待细胞培养至第3代后,取生长状态良好者,加入成骨向分化诱导液进行体外诱导培养;(2)犬PDLSCs的培养取成年拉布拉多犬一只,消毒铺巾麻醉起效后,拔取左下颌三颗下前牙,用PBS缓冲液从根尖向牙冠方向反复冲洗多次,用锐利手术刀片刮取牙根中部1/3的牙周膜组织,剪碎后接种于培养皿中,添加适量DMEM,待细胞培养至第3代后,取生长状态良好者,加入成骨向分化诱导液进行体外诱导培养。(3)检测方法:MTT法检测两种基质干细胞的增殖差异;骨向诱导后1d、4d、7d、14d及21d,采用碱性磷酸酶(ALP)染色法和茜素红(ARS)染色法法检测两者成骨分化情况;骨向诱导后1d、4d、7d、14d及21d,RT-PCR检测成骨诱导后成骨相关基因表达情况。取诱导培养7d后的第三代拉布拉多犬 BMSCs和拉布拉多犬 PDLSCs,分别与2mm×Φ6mmβ-TCP复合。实验分为3组,即β-TCP组,犬BMSCs/β-TCP复合体组,犬 PDLSCs/β-TCP复合体组。将细胞体外与材料复合后,常规培养3d,利用扫描电镜观察细胞与材料的黏附情况。并将各组复合物植入裸鼠皮下,裸鼠常规饲养8周后取材,通过HE染色观察新骨形成情况,免疫组化检测成骨相关基因蛋白的表达。 结果:(1) BMSCs原代培养7d后,在显微镜下观察可见有细胞爬出,并大量增殖,细胞呈长梭状;(2)PDLSCs原代培养7d后,显微镜下观察可见有大量细胞从牙周膜组织块中爬出,成放射状分布,细胞呈长梭状。两者在细胞形态上无明显差异;(3)MTT检测显示两者均有良好的体外增殖能力,其中BMSCs的增殖能力稍强;(4)ALP和ARS的染色结果显示两者随诱导时间的增加均有阳性显色,且阳性染色结果渐强,同一时间点BMSCs的染色比PDLSCs的深;(5)RT-PCR结果显示,在成骨诱导的过程中,成骨诱导相关基因BMP2、OCN、 RUNX2、HIF-1α、VEGF、CLOOAGEN-1等都有明显的表达,与PDLSCs组相比,BMSC组BMP2基因在骨诱导1d表达显著高于PDLSCs组(P<0.01)但在骨诱导的7d和14d PDLSCs组BMP2基因表达要高于BMSC组(P<0.01)。BMSCs组 OCN基因,基因在骨诱导14d时表达明显强于PDLSCs组(P<0.01)。RUNX2两组中都有高表达但是结果显示无统计学差异。BMSCs组HIF-1α,基因在骨诱导4d时表达明显低于PDLSCs组(P<0.01)。COLLAGEN-1 BMSCs组基因在骨诱导1d、4d、7d及14d时表达明显高于PDLSCs组(P<0.01)。 扫描电镜结果表明犬BMSCs和犬PDLSCs均可在β-TCP支架材料上正常生长。两种细胞均以较高的细胞密度生长于β-TCP表面及孔隙中,与骨架材料结合较好。裸鼠皮下组织切片HE染色结果显示,犬BMSCs和犬PDLSCs组都有新生骨样组织形成,免疫组织化学结果显示,犬 BMSCs组 BMP-2和 OCN表达量略高于犬PDLSCs组。 结论:BMSCs和犬PDLSCs经体外诱导后都具有一定的成骨性能,其中BMSCs的成骨能力较PDLSCs的成骨能力强。