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肝癌(liver cancer)是最常见威胁人类健康的肝脏恶性肿瘤。肝炎-肝硬化-肝癌,这一发展模式得到支持。肝纤维化是各种慢性肝病共同的病理学特征,也是慢性肝病进展到肝硬化的必经阶段。乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenases,ADH)和乙醛脱氢酶(aldehyde dehydrogenases,ALDH)主要存在于肝细胞中。ADH主要参与乙醇代谢,乙醇经氧化生成乙醛,乙醛具有肝脏毒性,能诱发癌症。同时ADH也参与视黄醇代谢,视黄醇及其代谢物参与肝炎及肝纤维化的进程,近期结果也显示ADH的缺乏能抑制肝纤维化。据报道,和癌旁的正常组织相比,肝癌组织中ADHI活性出现升高。肝癌患者血清中ADH活性较健康人也出现升高。本室前期结果显示,和正常肝组织相比,肝癌患者的肝纤维化组织中总ADH、ADHI、ADHII酶活性均明显升高,而总ALDH和ALDH2酶活性没有改变。上述结果显示,ADH活性升高可能和肝纤维化甚至肝癌存在关系,但肝癌发展的各个阶段血清和组织中ADH活性是如何改变的,ADH活性的升高是肝损伤的结果还是原因,其升高是否存在对肝损伤的易感性有待实验进一步研究。本实验拟选择二乙基亚硝胺(diethylnitrosamine,DEN)制备的大鼠肝癌模型为研究对象,测定大鼠在诱导的不同阶段ADH活性,分析大鼠血浆中ADH基础活性和肝损伤相关指标的相关性,并分析肝组织中ADH、ALDH活性和肝损伤相关指标的相关性,以期探讨ADH在肝纤维化甚至肝癌发展中所起的作用。方法1大鼠肝癌模型建立1.1动物分组和给药方法54只SD雄性大鼠,分成2组,对照组10只,模型组44只,适应性喂养后,模型组1-4周腹腔注射50 mg/kg DEN,每周两次,5-14周改为腹腔注射50mg/kg DEN,每周一次,在诱导至12周时随机处死20只模型组大鼠,命名为模型A组。剩余大鼠继续按照上述方法给药,14周给药结束后继续饲养,于19周处死,此组大鼠命名为模型B组。对照组10只大鼠在19周处死。1.2动物观察与取材每天观察大鼠生理和精神状态,每周记录大鼠体重,对照组和模型B组于给药前第0周,及开始给药后第8、12、16、19周留取大鼠血浆。模型A组于给药前第0周,及开始给药后第8、12周留取大鼠血浆。大鼠处死后,取出肝脏,肝组织一部分进行病理检查,剩余部分放入液氮。1.3肝匀浆的制备及蛋白浓度测定称取适量肝组织,加入9倍体积的匀浆介质,制成10%组织匀浆,离心取上清,用BCA法测定肝匀浆蛋白浓度。1.4血浆和肝匀浆中ALT、AST活性测定血浆和肝匀浆中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)活性参照试剂盒说明书通过酶标仪测定。1.5肝组织病理染色测定对照组和A、B模型组大鼠肝组织切片进行HE、masson染色,并根据Ishak评分系统对肝标本进行分级,并测定了masson染色后纤维化面积占比。1.6肝组织免疫组化测定通过免疫组化方法测定对照组和A、B模型组大鼠细胞增殖指数(Ki67)、增殖细胞核抗原(Proliferating Cell Nuclear Antigen,PCNA)、胎盘型谷胱甘肽硫转移酶(Glutathione S-transferase placental form,GST-p)蛋白的表达水平和表达位置。2血浆ADH和肝匀浆ADH、ALDH活性测定ADH催化氧化型辅酶Ⅰ(NAD+)反应生成还原型辅酶I(NADH),NADH在340 nm处有吸收,通过测定340 nm处吸光度变化得到ADH活性,血浆和肝匀浆中ADH活性用此原理的试剂盒测定。ALDH催化NAD+反应生成NADH,测定340 nm处吸光度变化得到ALDH活性。肝匀浆中ALDH活性用此原理试剂盒测定。3统计方法采用SPSS17.0软件对各项数据资料进行统计学分析。两组间数据的比较采用独立样本t检验,三组及三组以上数据的比较用单因素方差分析,ADH、ALDH活性、ADH/ALDH与肝损伤相关指标间的相关性采用Person相关,检验水准α为0.05。结果1大鼠肝癌模型建立1.1大鼠体重肝重与对照组相比,模型组大鼠体重从诱模第2周到处死时均下降(P<0.001)。和对照组相比,模型A组肝重无明显改变(P>0.05),肝重/体重明显升高(P<0.001);模型B组大鼠肝重升高(P<0.001),肝重/体重升高(P<0.001)。1.2大鼠存活情况模型组大鼠在诱导的前12周无死亡,在15-19周陆续死亡14只。1.3血浆和肝匀浆中ALT、AST活性与对照组相比,在8、12、16和19周模型组大鼠血浆中ALT、AST活性均有明显升高(P<0.001)。与对照组相比,模型A组大鼠肝匀浆中ALT活性下降(P<0.05),模型B组大鼠肝匀浆中ALT活性下降更明显(P<0.01);与对照组相比,模型A组大鼠肝匀浆中AST活性升高(P<0.05),模型B组大鼠肝匀浆中AST活性升高更明显(P<0.01);与对照组相比,A、B模型组AST/ALT比值均升高(P<0.001)。1.4病理染色结果和成癌率与对照组相比,A、B模型组大鼠肝组织Ishak评分和masson染色后纤维化所占面积均明显升高(P<0.001)。模型A组(12周处死)大鼠均出现不同程度的肝纤维化。模型B组(19周处死)有5只大鼠出现肝腺瘤,9只出现肝细胞癌,成癌率为66.7%。1.5肝损伤相关指标的结果与对照组相比,A、B模型组大鼠肝脏切片中Ki67、PCNA阳性细胞率和GST-p平均光密度值均增加(P<0.01)。与模型A组相比,模型B组Ki67和PCNA阳性细胞率下降(P<0.01),GST-p平均光密度值无明显改变(P>0.05)。2大鼠ADH、ALDH活性2.1大鼠血浆中ADH活性与对照组相比,模型组大鼠血浆中ADH活性在16周(24.21±9.86 U/ml)和19周(24.56±9.65 U/ml)升高(P<0.05),在0、8、12周无明显改变(P>0.05)。2.2大鼠肝匀浆中ADH、ALDH活性与对照组大鼠肝匀浆中ADH活性(3.43±1.07 U/mg prot)相比,大鼠肝匀浆ADH活性在模型A组(4.50±1.05 U/mg prot)、B(4.77±2.11 U/mg prot)组均升高(P<0.05);对照组大鼠肝匀浆中ALDH活性为9.96±1.52 U/g prot,A、B模型组大鼠肝匀浆中ALDH活性分别为46.02±14.10 U/g prot和30.33±9.80U/g prot,较对照组显著升高(P<0.001),与模型A组相比,模型B组大鼠肝匀浆中ALDH活性下降34.1%(P<0.001)。3大鼠ADH、ALDH和肝脏损伤相关指标的关系3.1大鼠ADH基础活性和肝脏损伤相关指标的关系模型A组大鼠第0周血浆中ADH基础活性和12周测定的4个肝脏损伤相关指标有相关性(masson面积%,Ki67+%,PCNA+%,GST-p平均光密度值),相关系数分别为0.453、0.512、0.457、0.450(P<0.05)。而模型B组大鼠血浆中ADH基础活性和19周测定的肝脏损伤相关指标不存在相关性(P>0.05)。3.2大鼠肝匀浆中ADH、ALDH活性和和肝脏损伤相关指标的关系模型B组大鼠肝匀浆中ADH活性和19周测定的5个肝脏损伤相关指标(肝重/体重,结节数量,结节最大直径,结节累积直径,Ki67+%)有相关性,相关系数分别为0.567、0.499、0.438、0.626、0.506(P<0.05)。模型B组肝匀浆中ADH/ALDH和19周测定的4个肝脏损伤相关指标(肝重/体重,结节数量,结节最大直径,结节累积直径)存在相关性,相关系数分别为0.720、0.476、0.522、0.755(P<0.01)。结论1.模型组大鼠血浆中ADH活性在16周和19周较对照组升高,肝匀浆中ADH活性在12周和19周较对照组升高。2.12周和19周DEN诱导的肝癌模型大鼠肝匀浆中ALDH活性较对照组升高。3.大鼠血浆中ADH基础活性升高是肝纤维化的易感因素。