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背景和研究目的胃肠胰神经内分泌肿瘤(GEP-NENs)是最常见的NENs类型,近年来其发病率呈现上升趋势。但其发生机制不清,且缺乏有效的诊断和治疗标志物。本课题组前期研究发现,CD147在正常胰岛中不表达,在绝大部分胰腺神经内分泌肿瘤(pNENs)中表达,且随着肿瘤恶性程度的增高,CD147的表达水平增高。提示CD147可能参与了 pNENs的肿瘤发生,且表现为促癌作用,但对CD147在胃肠NENs中的表达情况,在pNENs中的作用及其机制,以及在正常胰岛中不表达的分子机制尚需进一步研究。因此本研究主要包括以下几个部分:CD147抗体验证;检测CD147在胃肠NENs中的表达表达研究;检测CD147、MCT-1、MCT-4慢性胰腺炎中的表达,MCT-1、MCT-4、PDX1、nkx6.1、Pax-6在pNENs中的表达并分析其与CD147表达的相关性研究;pNENs中CD147基因的序列变异研究。方法1.构建CD147真核过表达载体,转染HEK293T细胞,提取蛋白行去糖基化处理后,CD147抗体和抗His抗体进行western blot验证。若CD147抗体和抗His(C端)抗体能得到同样分子量的融合蛋白目的条带,证明抗体识别的是CD147分子。2.采用免疫组化方法检测109例胃肠NENs中CD147的表达,检测36例慢性胰腺炎中 CD147、MCT-1、MCT-4 的表达,及 42 例 pNENs 中 MCT-1、MCT-4、PDX1、nkx6.1、Pax-6的表达,并与CD147表达进行相关性分析。3.选取29例pNENs患者的正常组织和肿瘤组织配对石蜡样本共60个,对CD147基因进行测序检测。结果第一部分CD147抗体验证:证实前期实验所用CD147单克隆抗体特异性识别地为CD147分子,抗体可用。第二部分CD147在胃肠NENs中的表达研究:1.CD147在胃、十二指肠、结直肠NENs中均有表达,免疫表型可表现为浆型、膜型、膜浆型,其阳性表达率分别为65.7%、76.5%、19.3%。2.CD147在胃肠NENs中的表达水平与组织学分级呈显著正相关,在胃NENs中CD147的免疫表型与其表达水平有关,表达水平越高,膜型的比例越高。第三部分CD147、MCT-1、MCT-4在慢性胰腺炎及pNENs瘤旁正常胰岛中表达的研究:CD147、MCT-1、MCT-4在36例慢性胰腺炎中的胰岛中均呈阴性表达。42例pNENs病例中,MCT-1、MCT-4在瘤旁正常腺泡和导管及正常胰岛中均呈阴性表达。第四部分MCT-1、MCT-4、PDX1、nkx6.1、Pax-6在pNENs中的表达及其与CD147 表达的相关性研究:1.MCT-1、MCT-4、Pax-6、nkx6.1、PDX1 在 pNENs中均呈阳性表达。2.MCT-1、MCT-4的表达水平与肿瘤的大小、组织学分级、pTNM分期呈显著正相关,而Pax-6、nkx6.1、PDX1的表达水平与肿瘤的大小、组织学分级、pTNM分期呈显著负相关。3.发生淋巴结转移或远处转移的肿瘤中的MCT-1、MCT-4表达水平要高于未发生淋巴结转移或远处转移的;而未发生局部浸润和/或淋巴结转移的肿瘤中Pax-6的表达水平比发生局部浸润和/或淋巴结转移的高,无远处转移的比有远处转移的肿瘤Pax-6、PDX1表达水平高。4.CD147与MCT-1的表达水平呈显著正相关,与MCT-4的表达水平无相关性,CD147与PDX1、nkx6.1、Pax-6的表达水平呈显著负相关。第五部分pNENs中CD147基因的序列变异研究:29例pNENs患者的60个组织样本中共检测出47个CD147基因变异位点。其中直径>2cm的肿瘤中19:580388C>G(rs2229664)CG 杂合基因型、19:582775A>G GG 纯合基因型、19:582927T>A(rs8259)AA纯合基因型型比≦2cm的多,差异有统计学意义。19:579627C>T(rs1803202)在肿瘤组织或正常与肿瘤组织同时存在的T纯合基因型比C/T杂合基因型多,差异有统计学意义。19:582927T>A在正常组织和肿瘤组织中的变异(AA基因型和A/T杂合基因型)在不同的肿瘤组织学分级间存在显著差异,组织学分级越高,肿瘤组织中存在的19:582927T>A变异(AA基因型和A/T杂合基因型)越多。结论1.CD147在GEP-NENs不同部位中的表达有所差异。2.CD147在胃肠NENs中的表达水平与组织学分级呈显著正相关,其表达水平高可能提示肿瘤的分化差、恶性程度高,可能能作为评估胃肠NENs严重程度的一个指标。3.CD147、MCT-1、MCT-4在慢性胰腺炎和pNENs瘤旁胰岛中均呈阴性表达。4.MCT-1、MCT-4的表达水平与肿瘤的大小、组织学分级、pTNM分期呈显著正相关;Pax-6、nkx6.1、PDX1的表达水平与肿瘤的大小、组织学分级、pTNM分期呈显著负相关,其表达水平高可能能提示肿瘤的分化好、恶性程度低。5.pNENs中CD147与MCT-1的表达水平呈显著正相关,与PDX1、nkx6.1、Pax-6的表达水平呈显著负相关。提示MCT-1、PDX1、nkx6.1、Pax-6可能参与了 CD147在pNENs中的作用。6.在pNENs组织中共检测出4个与临床病理特征相关的CD147基因变异位点rs2229664C>G、19:582775A>G、rs8259T>A、rs1803202C>T,可能具有一定临床意义,尚需进一步分析验证。