背景：子宫内膜癌是常见的妇产科恶性肿瘤之一。2011年美国约有8,010名妇女死于子宫内膜癌,有近47,130名患者新诊断为子宫内膜癌。在所有子宫内膜癌患者中,约70%的患者其子宫内膜癌病灶局限于宫体,患者5年生存率高达85%。美国妇科肿瘤组单药或联合化疗药物临床试验(包括铂类,紫杉醇类及蒽环类抗生素类等),晚期(FIGO分期Ⅲ、Ⅳ期)和复发性子宫内膜癌患者中仅有少数患者表现为对化疗药物有较好反应,患者临床症状、体征,实验室检查以及影像学检查达到临床完全缓解。虽然子宫内膜癌患者经联合化疗后缓解率提高,但患者无病进展生存期(PFS)较短,一般为5-7个月,而且病死率较高。这些临床数据表明目前亟待开发新型有效子宫内膜癌化疗预防和治疗药物。天然食品是众多化疗药物有效活性成份的重要来源之一,并对子宫内膜癌和其他类型肿瘤起化疗预防和治疗作用。已有研究发现姜干粉或可溶性提取液能够诱导皮肤癌、乳腺癌、前列腺癌、结肠癌以及卵巢癌细胞系细胞周期停滞和凋亡。在SENCAR小鼠肿瘤模型中,通过皮肤局部涂抹姜的乙醇萃取液可以降低DMBA/TPA诱导的皮肤肿瘤的发病率以及肿瘤大小和数量。已有研究显示,姜干粉和可溶性提取液中起抗癌作用的主要生物活性成份是多聚酚类化合物,如4-、6-、8-、10-gingerols, paradol和shogaol。对不同肿瘤的体外和体内研究显示,多聚酚类化合物尤其是gingerols具有有效抗肿瘤细胞增生和抗肿瘤血管形成的特性。研究显示,6-gingerol可以通过诱导CyclinD蛋白降解及激活β-catenin、PKC delta和GSK3beta等信号通路的机制抑制人结直肠肿瘤细胞增生,诱导肿瘤细胞凋亡和G1期细胞周期停滞。姜有效活性成份shagaol可以通过抑制NF-κB激活以及降低VEGF(?)IL-8分泌的机制显著抑制上皮性卵巢癌细胞系细胞增生。6-gingerol可以通过增加凋亡相关p53蛋白及其下游促凋亡蛋白Bax表达,同时降低抗凋亡蛋白Bcl-2表达等机制诱导前列腺癌细胞系LnCap细胞凋亡。提取姜有效活性成份的途径主要有两种。一种是通过干燥生姜的方法获得姜干粉,另一种是通过加热生姜的方法获得姜的可溶性提取液。也有研究发现通过蒸汽蒸馏生姜根茎的方法也能够获得姜的有效生物活性成分。到目前为止对姜蒸汽蒸馏提取物抗癌特性的研究甚少。之前研究表明姜干粉和可溶性提取物中起抗癌作用的主要活性成份是多聚酚类化合物,而姜蒸气蒸馏提取物的化学分析显示姜蒸馏提取物中多聚酚类化合物含量极少。姜蒸汽蒸馏提取物对有效抗癌成份及其作用机制有待研究。研究目的：本研究旨在探讨姜蒸汽蒸馏提取物(SDGE)的化学组成,有效抗肿瘤化学成份；姜蒸汽蒸馏提取物(SDGE)对子宫内膜癌细胞增生的影响以及其抗癌作用机制。1.方法：1.1提取姜蒸汽蒸馏产物(SDGE)从供应商处购得生姜,用蒸馏水洗净后将生姜切成0.5厘米大小块状。将250-300克姜转移到1000毫升Clevenger水蒸汽蒸馏装置的圆底烧瓶中,注入500毫升去离子水(18MOhm-cm)浸没姜。持续加热圆底烧瓶4-6小时。从clevenger装置中分离的油状混合物比水轻,可通过定期引流分离管中的液体来进行收集。通过离心分离得到上层淡黄色提取物(SDGE)后立即分装在离心管中,-80℃冰箱保存实验前取出。通过称量SDGE质量和体积计算出SDGE密度为0.87g/ml,这个数值用于换算提取物的浓度,方便之后生物学实验的进行。1.2细胞增殖实验(MTT实验)1.21四甲基偶氮唑盐摄取法检测SDGE. citral和6-gingerol对子宫内膜癌细胞系Ishikawa和ECC-1细胞增生的影响。用培养基重悬细胞以5000个／孔的密度接种于96孔板。用不同浓度梯度SDGE (0.025μg/ml、0.25μg/ml、2.5μg/ml、6.25μ/ml、12.5μg/ml), citral (1.5μM、15μM、150μM)和6-gingerol (1.5μM、15μM、150μM)处理细胞,细胞置于5%CO2,37℃细胞培养箱中培养24、48和72小时后,每孔加入20μl3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT),细胞培养板置于5%CO2,37℃细胞培养箱中再孵育3小时。3小时后每孔中加入100μl DMSO溶液溶解甲瓒结晶。细胞培养板置于水平摇床上低速震荡5分钟。紫外分光光度计波长570nm处读取吸光值OD。1.22SDGE联合铯-137γ放射线照射或顺铂溶液处理细胞四甲基偶氮唑盐摄取法(MTT实验)检测SDGE是否能够加强放射线或化疗试剂对子宫内膜癌细胞的增生抑制作用。实验第一天将Ishikawa或ECC-1细胞以5000个/孔的密度接种于96孔细胞培养板。细胞贴壁后,在细胞培养板中加入单纯细胞培养基或2.5μg/ml SDGE溶液,细胞培养板置于5%CO2,37℃细胞培养箱中培养24小时。实验第三天,在一部分细胞培养孔中加入顺铂溶液(5μM)；另一部分细胞培养孔用铯-137放射仪进行照射,单次照射剂量为4Gy。细胞培养板置于5%CO2,37℃细胞培养箱中继续培养72小时。用四甲基偶氮唑盐摄取法检测不同处理条件对子宫内膜癌细胞增生的影响,实验步骤如上。1.3气相色谱-质谱(GC-MS)技术分析SDGE化学组成用GC-17A气相色谱仪及QP-5000四极质谱分析仪(Shimadzu公司)分析SDGE化学组成。分析前将20μl新鲜解冻的SDGE样品加入到1000μl戊烷中进行稀释。吸取1μl稀释后的SDGE样品注入气相色谱仪。设置GC-MS参数,分流比：1：50；氦气流速：1.4ml/min。设置GC-MS内非极性RTX-5MS柱(长30米,内径0.25毫米,膜厚0.25微米)柱起始温度为70℃,以4℃/min速度加热至180℃后维持。设置GC-MS电离检测方式为全扫描,阳离子模式质荷比(m/z)范围：41-300。实验结束后通过搜索美国国家标准技术研究所(NIST图书馆)将获得的数据与Adams算术保留指数值进行对比进而鉴别SDGE的化合物组成。1.4细胞凋亡实验用FITC-Annexin V流式细胞实验方法(BD公司凋亡检测试剂盒)检测细胞凋亡。方法如下：在2x106个细胞中加入0.25μg/ml SDGE和或100μM Pifithrin-α,细胞培养瓶置于5%CO2,37℃细胞培养箱中培养0-16小时。用胰酶进行消化,收集细胞后用冷PBS缓冲液冲洗2遍,用l×结合缓冲液(10mM HEPES/NaOH, pH7.4,140mM NaCl,2.5mM CaCl2)重悬制成1×106个/ml细胞悬液。将100μl细胞悬液(1x105个细胞)转移至5ml流式管中,加入5μlFITC-Annexin V和5μl propidium iodide (PI)进行染色,轻轻涡旋震荡后,室温避光孵育15分钟。l×结合缓冲液洗细胞一次,用500μl1×结合缓冲液重悬。将细胞置于冰上避光,用FACSCalibur流式细胞仪进行检测。流式细胞实验结果用FlowJo软件进行分析。1.5细胞周期实验用不同浓度SDGE (250ng/ml或2.5μg/ml)处理子宫内膜癌细胞24、48和72小时后,胰酶消化收集细胞。PBS缓冲液洗后重悬,涡旋震荡同时逐滴加入75%乙醇进行固定。PBS缓冲液洗细胞后加入propidium iodide (PI)进行染色。流式细胞仪检测细胞周期状态,步骤如上,流式细胞实验结果用FlowJo软件进行分析。1.6蛋白质印迹实验用250ng/ml SDGE处理细胞特定时间后收集细胞,冷PBS缓冲液冲洗,离心去掉上清,往细胞沉淀中加入RIPA缓冲液(Pierce公司)进行细胞裂解,裂解液中加入蛋白酶抑制剂cocktail (Thermo公司)。超声裂解细胞后离心收集上清,BCA实验方法测定蛋白质浓度。取25μg蛋白质样品加入聚丙烯酰胺凝胶上样孔中。7.5或12%变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离,电泳结束后将分离蛋白转到PVDF膜上。PVDF膜用含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液室温封闭一小时,特异性一抗孵育过夜。第二天用TBST缓冲液洗膜3次后,过氧化物酶结合二抗孵育1小时。TBST缓冲液洗膜3次后用West Dura或VVest Femto化学发光试剂盒(Thermo公司)进行显色。应用数字凝胶成像系统扫描胶片。实验结果用Image J软件进行定量分析。1.7线粒体膜电位分析将子宫内膜癌细胞接种在T25细胞培养瓶中。细胞指数生长期内,在细胞培养基中加入0.025μg/ml或025ug/ml SDGE;对照组加入等量DMSO。细胞培养瓶置于5%CO2,37℃细胞培养箱中培养24小时。用PBS缓冲液洗细胞后胰酶消化收集细胞,制成1×106个/ml细胞悬液。将100μl细胞悬液(1×106个细胞)转移至5ml流式管中,加入40nM DiOC637℃孵育30分钟。洗细胞后用含2%FBS PBS缓冲液400μl重悬。FACSCALIBUR流式细胞仪检测线粒体膜电位变化。实验结果用FlowJo软件进行分析。1.8钙离子内流实验分析胰酶消化收集对数生长期子宫内膜癌Ishikawa细胞。用PBS缓冲液洗涤3次后,用含0.5%BSA培养基重悬,使细胞密度为1×10Vml。向1×107/ml细胞悬液中加入2mM Indo1-AM和4mM probenecid,置于5%CO2,37℃细胞培养箱中孵育30分钟。用PBS缓冲液洗涤3次,用含1mM CaCl2的0.5%BSA DPBS缓冲液重悬,使细胞密度为2×106/ml。用35微米滤器过滤细胞,并保持细胞在37℃。流式细胞仪进行分析时,初始3分钟检测细胞内基础钙离子浓度,然后各试管中分别加入0.025μg/ml、0.25μg/ml.2.5μg/ml SDGE或1μM Ionomycin继续上机检测7分钟,观察记录钙离子流量变化。实验结果用FlowJo软件进行分析。1.9统计分析采用单样本T检验,P≤0.05被认为有显著性差异。数据分析用GraphPadPrizm软件。2结果2.1蒸汽蒸馏实验从姜中提取姜蒸汽蒸馏产物(SDGE)通过改良Clevenger水蒸汽蒸馏装置我们可以方便地从姜中提取出SDGE,从250克姜中可以提取出大约300毫克精油。我们先后用五批姜提取SDGE。其中两批是从印度不巴内什瓦尔购买,在当地实验室通过蒸汽蒸馏方法提取SDGE。其余三批是从美国威斯康辛州购买,在威斯康辛大学实验室提取SDGE。这五批姜提取的SDGE产量大致相同,通过计算SDGE密度约为0.8g/L2.2姜蒸汽蒸馏提取物(SDGE)是有效的子宫内膜癌细胞增生抑制剂首先检测SDGE对子宫内膜癌细胞系ECC-1和Ishikawa细胞增生的影响。MTT实验发现,SDGE低浓度250ng/ml时两种子宫内膜癌细胞增生即受抑制(图1A、B)：SDGE高浓度2.5μg/ml时,两种子宫内膜癌细胞增生显著受到抑制(P<0.05)。图1A、B中实验结果是3次独立MTT实验数据的累计,实验用SDGE来自3个不同产地。在实验中SDGE每个浓度设有16个复孔。因此图1中每点是48个独立数据的平均值。实验结果仅有微小的差异,可重复性高,能清楚地说明SDGE对子宫内膜癌细胞系ECC-1和Ishikawa细胞增生的影响。MTT实验显示72小时,SDGE对两种细胞的半数抑制浓度IC50约为1.25μg/ml。2.3SDGE联合铯-137γ放射线照射或顺铂试剂加强对子宫内膜癌细胞的增生抑制作用晚期(FIGO分期Ⅲ、Ⅳ期)和复发性子宫内膜癌的处理原则是放疗和化疗。因此我们进一步分析SDGE联合铯-137γ放射线照射或顺铂试剂是否能够加强对子宫内膜癌细胞的增生抑制作用。MTT实验结果显示：SDGE对两种子宫内膜癌细胞系的增生抑制率为40%；SDGE对ECC-1细胞增生抑制率与铯-137γ放射线照射对两种细胞的增生抑制率相同(图1C、D)；而Ishikawa细胞,SDGE对Ishikawa细胞的增生抑制率比铯-137γ放射线照射对Ishikawa田胞的增生抑制率高10%(图1C),SDGE比铯-137γ放射线照射更有效抑制Ishikawa细胞增生；对两种子宫内膜癌细胞系ECC-1和Ishikawa细胞,SDGE联合铯-137γ放射线照射对细胞增生抑制率比单独铯-137γ放射线照射对细胞的增生抑制率高23-25%(图1C、D),说明SDGE加强铯-137γ放射线照射对子宫内膜癌细胞的增生抑制作用。我们进一步分析了SDGE联合顺铂试剂对Ishikawa和ECC1细胞增生的影响。MTT实验结果显示：Ishikawa细胞,72小时SDGE联合顺铂试剂对细胞的增生抑制率比单独顺铂处理对细胞增生抑制率高26%(图1E)；而ECC-1细胞,SDGE联合顺铂试剂与顺铂单独对细胞的增生抑制率相同(图1F)通过MTT实验我们还比较了SDGE与顺铂的细胞毒性。与对照组相比,顺铂(5μM;1.5μg/ml)对Ishikawa(?)田胞和ECC-1细胞的增生抑制率分别为59%和61%(图1E、F)。而SDGE (2.5μg/ml)对Ishikawa和ECC-1细胞的增生抑制率分别为37%和42%(图1E、F)。这些数据提示,SDGE与顺铂有相同有效抑制子宫内膜癌细胞增生的作用,为进一步研究SDGE抗癌机制提供有力的依据。2.4SDGE诱导子宫内膜癌细胞凋亡MTT实验显示SDGE是一种有效的子宫内膜癌细胞增生抑制剂。细胞凋亡实验发现子宫内膜癌细胞增生降低是SDGE直接诱导子宫内膜癌细胞凋亡的结果。流式细胞实验显示,用低浓度SDGE (250μg/ml)处理细胞后,细胞表面AnnexinV和PI染色增加(图2A)。在细胞培养基中加入SDGE后,最早在30分钟即能观察到FITC-AnnexinV染色阳性细胞数增加(图2A)。蛋白印迹实验证实,用SDGE (250ng/ml)处理ECC-1(数据未显示)和Ishikawa细胞24,48和72小时后,裂解caspase-3蛋白表达增加(图2B)。我们进一步检测SDGE对子宫内膜癌细胞周期状态的影响。用SDGE (250ng/ml或2.5μg/ml)处理Ishikawa细胞24,48和72小时后,细胞用PI进行染色,流式细胞仪检测细胞周期状态改变(图2C)。流式细胞实验分析显示,SDGE对细胞周期状态没有造成显著的影响,仅观察到细胞周期中S期细胞比例轻微降低。而且仅在高浓度SDGE2.5μg/ml处理Ishikawa (?)田胞时观察到。而低浓度250ng/ml SDGE处理细胞时,细胞周期状态没有任何改变,即便这个浓度已经能诱导子宫内膜癌细胞凋亡。2.5SDGE的化学组成SDGE诱导子宫内膜癌细胞凋亡的特性促使我们进一步研究SDGE的化学组成以及其中起抗癌作用的有效生物活性成份。我们用气象色谱-质谱技术(GC-MS)对三批不同产地SDGE进行分析。戊烷稀释SDGE后,挥发成分在通过非极性RTX-5MS色谱柱时得到分离(图3),色谱流出曲线上的各个峰所代表的成分通过电子离子质谱仪进行鉴定。通过分析色谱流出曲线上每个峰的滞留时间,峰面积或峰高值,可以鉴定SDGE的化学组成及各成份所占比例。我们总共从SDGE中鉴别出22种化合物及其相对含量(表1)。数据分析显示从不同产地姜提取的SDGE化学组成基本一致。气象色谱-质谱技术分析结果显示,SDGE中不含多聚酚类化合物,如gingerol, shogaol和paradol等。而在之前的研究中已经报道,姜干粉和可溶性提取液中的有效抗癌活性成份正是这些多聚酚类化合物[20,24,25,36]。因此我们用纯化的6-gingerol进行MTT实验检测其对子宫内膜癌细胞增生的影响。MTT实验显示即便在高浓度150μM时,6-gingerol仍不能有效抑制子宫内膜癌细胞增生(图4A和4B)。6-gingerol的MTT实验结果进一步支持我们的GC-MS分析。气象色谱-质谱分析结果显示,SDGE的主要组成成份是类萜类化合物。而citral,是Neral和geranial两种类萜异构体的混合物,占到SDGE化合物组成的35-45%(表1)。MTT实验发现,citral能显著降低Ishikawa和ECC-1田胞增生。Citral对两种细胞的半数抑制摩尔浓度IC50约为15-25μM(图4C和4D)。Citral的半数抑制浓度IC50约为2.28-3.8μg/ml。而SDGE有效的IC5。为1.25μg/ml,因neral和geranial仅占SDGE组成的35-45%,因此SDGE的IC50相当于citral2.8-3.7μM。这个浓度要显著低于MTT实验得出的citral半数抑制浓度15-25μM(图4C和4D)。因此我们得出以下结论,在SDGE中除外citral,还有其他的类萜类化合物也贡献了显著的抗癌作用。在接下来的研究中,我们仍把SDGE而非citral作为机制研究的主要对象。2.6SDGE诱导细胞内钙离子流量增加,线粒体膜电位下降用SDGE (0.025μg/ml、0.25μg/ml、2.5μg/ml)处理Ishikawa细胞后,细胞内钙离子流量显著增加(图5A)。在Ishikawa细胞中加入SDGE初始3分钟后即可以观察到细胞内钙离子流量增加。钙离子通量的时间动力学曲线形态与ionomycin (1μM)的时间动力学曲线形态相似。细胞内钙离子流量与SDGE浓度成正比。实验显示SDGE (2.5μg/ml)诱导的细胞内钙离子流量峰值是ionomycin (1μM)钙流量峰值的60-70%。在细胞中加入Ionomycin后细胞内钙离子流量急剧增加,在一分钟内迅速降低。而SDGE (0.025μg/ml、0.25μg/ml、2.5μg/ml)诱导的细胞内钙离子流量增加以及下降相对缓慢(图5A)。细胞中加入SDGE之后5-6分钟细胞内钙离子流量下降但仍高于初始3分钟基线钙离子水平(图5A)。在子宫内膜癌细胞Ishikawa培养基中加入SDGE后,细胞内钙离子流量增加,细胞凋亡诱导增加,说明线粒体功能发生缺陷。我们进一步用流式细胞实验检测线粒体膜电位改变,实验结果显示用SDGE (25ng/ml或250ng/ml)处理Ishikawa细胞后,细胞线粒体膜电位降低两倍(图5B)2.7SDGE诱导Bax/Bcl-2比值增加Bcl-2是一种线粒体外膜相关抗凋亡蛋白。实验显示SDGE处理Ishikawa细胞后,细胞线粒体膜电位下降。促使我们进一步研究SDGE对子宫内膜癌细胞Bcl-2蛋白表达的影响。我们用SDGE (250ng/ml)处理子Ishikawa细胞特定时间,实验结果显示24,48和72小时后Ishikawa细胞Bcl-2蛋白表达降低,而促凋亡Bax蛋白表达没有明显改变,Bax/Bcl-2比值增加1.3-2.0倍(图6A),ECC-1数据未显示。2.8SDGE激活p53信号通路p53肿瘤抑癌基因是一个转录因子,在调控细胞死亡和各种细胞程序中起关键作用。p53参与调控的细胞事件包括细胞周期、细胞凋亡、DNA损伤修复以及衰老等。实验显示SDGE能够诱导子宫内膜癌细胞凋亡,因此我们进一步研究SDGE对p53蛋白的影响。蛋白质印迹实验显示,SDGE (250ng/ml)处理Ishikawa细胞后,p53蛋白15位丝氨酸磷酸化迅速增加(图6B),说明p53被激活。pifithrin-a是一种特异性p53蛋白抑制剂[37]。用pifithrin-a预处理Ishikawa田胞后,流式细胞实验显示SDGE (250ng/ml)诱导的子宫内膜癌细胞凋亡完全被抑制(图6C)。对照组中细胞FITC-Annexin V染色阳性率约为11%(细胞培养基中不加入SDGE或pifithrin-a); SDGE处理组细胞FITC-Annexin V染色阳性率约为39.5%；pifithrin-a预处理组细胞FITC-Annexin V染色阳性率约为10%。细胞凋亡实验进一步证实,SDGE诱导子宫内膜癌细胞凋亡是通过激活p53信号通路。2.9SDGE不能诱导p53neg SKOV3细胞凋亡有研究报道卵巢癌SKOV-3细胞系不表达p53蛋白。因此我们采用SKOV3细胞研究在无p53蛋白存在情况下,SDGE对细胞凋亡的影响。流式细胞实验显示,用SDGE (250ng/ml)处理SKOV-3细胞30分钟,2、4和16小时后,细胞表面FITC-Annexin V染色率没有改变,SKOV3细胞无凋亡发生(图6D)我们进一步用蛋白质印迹实验证实SDGE处理SKOV-3细胞未发生凋亡,实验显示SDGE处理后细胞无裂解caspase3蛋白表达(图6E)3.结论：(1)SDGE主要组成成份是22种类萜类化合物。SDGE可通过激活p53信号通路诱导子宫内膜细胞凋亡。(2) SDGE及其纯化类萜类化合物可作为子宫内膜癌治疗剂值得进一步研究。