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目的:口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)在人类常见的恶性肿瘤中居第六位,全世界每年因OSCC死亡的患者约13万。其原因是OSCC的临床诊断困难,特别是早期OSCC的诊断。研究发现早期OSCC患者的5年生存率为80%,晚期OSCC患者的5年生存率为30%,然而不幸的是,三分之二的患者被诊断为OSCC时已经是晚期了,导致全部OSCC患者的5年生存率不到50%。因此,我们急需探索OSCC的早期诊断方法。近年来,研究者们深入研究并了解OSCC发生、发展的分子机制来提高早期OSCC的诊断率。舌鳞状细胞癌(tongue squamous cell carcinoma,TSCC)是最常见的口腔鳞癌,对其发生发展分子机制中相关因素的研究也越来越深入。电压门控型钾通道(voltage—galed K+channels,Kv)是细胞膜上种类最多的一类钾离子通道,研究发现在许多的肿瘤细胞株中Kv通道异常表达。Kv3.4可广泛分布在人体多种细胞浆和细胞膜表面上,在细胞微环境的调节中可能发挥重要作用。研究发现Kv3.4在口腔鳞癌中表达上调且与口腔鳞癌的发生、发展密切相关。EGFR是一种酪氨酸激酶受体,可以调节细胞的许多功能,如细胞的增殖和分化。EGFR靶向治疗已经广泛用于人类癌症治疗。研究发现EGFR异常表达与OSCC的发生、发展有密切的联系,并且可以作为癌症患者预后的重要判断指标。胞膜窖(caveolae)是存在于多种细胞表面的小凹结构,Caveolin-1是caveolae的主要结构蛋白,研究发现其在细胞生理过程中起着重要的作用,可以调节多种信号分子的活性,还可能参与人类肿瘤的发生发展,因此,在肿瘤的发生发展过程中Caveolin-1可能是一个关键分子参与生长相关的信号传导。方法:1.标准屏障环境下4-硝基喹啉-1-氧化物(4-nitro-quinoline-1-oxide,4NQO)水溶液诱导84只SD大鼠TSCC发生,收集SD大鼠舌黏膜癌变过程中的舌黏膜组织标本,一部分进行HE染色与免疫组化染色。根据HE染色结果,由两位经验丰富的病理医师盲法下读片确定病理分级;另一部分组织标本使用RNA保护液固定后转移至-80℃冰箱冷藏备用。2.应用免疫组化法检测各标本中Kv3.4蛋白、EGFR蛋白及Caveolin-1蛋白的表达情况,对免疫组化结果进行分析,探索Kv3.4蛋白、EGFR蛋白及Caveolin-1蛋白在舌鳞癌发生发展中的作用。3.采用实时荧光定量PCR法获得各组组织样本中Kv3.4基因、EGFR基因及Caveolin-1基因相对于内参基因GADPH的△CT值,进而计算各病变组织相对于正常组织中Kv3.4 m RNA、EGFR m RNA及Caveolin-1 m RNA的表达量,从而明确TSCC发生过程中Kv3.4蛋白、EGFR蛋白及Caveolin-1蛋白在转录水平是否发生了变化及其相关性。结果:1.采用4NQO饮水法成功诱导了SD大鼠舌鳞状细胞癌的发生,在实验过程中84只SD大鼠死亡4只,总共获得80例实验标本,对采集的SD大鼠舌黏膜组织样本病理分级后,获得18例正常组标本、9例上皮单纯增生组标本、11例轻度上皮异常增生组标本、12例中度上皮异常增生组标本、12例重度上皮异常增生组标本、18例鳞状细胞癌组标本。舌黏膜各病理分级之间样本量差异有统计学意义(χ2=44.503,P<0.05)。2.用免疫组化法检测Kv3.4、EGFR及Caveolin-1三种蛋白在舌黏膜标本中的表达情况。Kv3.4蛋白表达情况:正常黏膜44.44%(8/18)表达阳性,上皮单纯增生55.56%(5/9)表达阳性,轻度上皮异常增生72.73%(8/11)表达阳性,中度上皮异常增生75%(9/12)表达阳性,重度上皮异常增生83.33%(10/12)表达阳性,舌鳞状细胞癌94.44%(17/18)表达阳性;Kv3.4蛋白在舌黏膜癌变过程中表达升高,各组间阳性表达率差异有统计学意义(χ2=21.390,P<0.05);两两比较发现:Kv3.4蛋白在中度异常增生组、重度异常增生组、舌鳞癌组与正常黏膜组阳性表达率差异有统计学意义(P<0.05),在其余各组中差异无统计学意义(P>0.05)。2.EGFR蛋白表达情况:正常黏膜38.89%(7/18)表达阳性,上皮单纯增生44.44%(4/9)表达阳性,轻度上皮异常增生63.63%(7/11)表达阳性,中度上皮异常增生66.67%(8/12)表达阳性,重度上皮异常增生75%(9/12)表达阳性,舌鳞状细胞癌88.89%(16/18)表达阳性;EGFR蛋白在舌黏膜癌变过程中表达升高,各组间阳性表达率差异有统计学意义(χ2=20.040,P<0.05);两两比较发现:EGFR蛋白在正常舌黏膜组与舌鳞癌组的阳性表达率差异有统计学意义(P<0.05);在其余各组中差异无统计学意义(P>0.05)。3.Caveolin-1蛋白表达情况:正常黏膜11.11%(2/18)表达阳性,上皮单纯增生22.22%(2/9)表达阳性,轻度上皮异常增生27.27%(3/11)表达阳性,中度上皮异常增生50%(6/12)表达阳性,重度上皮异常增生66.67%(8/12)表达阳性,舌鳞状细胞癌77.78%(14/18)表达阳性;Caveolin-1蛋白在舌黏膜癌变过程中表达升高,各组间阳性表达率差异有统计学意义(χ2=25.946,P<0.05);两两比较发现:Caveolin-1蛋白在轻度异常增生组、舌鳞癌组与正常黏膜组的阳性表达率差异有统计学意义(P<0.05),在其余各组中差异无统计学意义(P>0.05)。4.实时荧光定量PCR法检测到75个组织标本中Kv3.4 m RNA、EGFR m RNA和Caveolin-1m RNA的相对表达量,75个组织标本分别为:17个正常舌黏膜标本,9个舌黏膜单纯增生标本,10个舌黏膜轻度异常增生标本,11个舌黏膜中度异常增生标本,10个舌黏膜重度异常增生标本,18个舌黏膜癌变标本。Kv3.4m RNA在正常舌黏膜组△CT值的平均值为7.999412,上皮单纯增生组为7.617778,上皮轻度、中度、重度异常增生组△CT值的平均值为7.352000、6.925455、5.780000,上皮癌变组△CT值的平均值为5.474444。结果显示除癌变组与上皮重度异常增生组、上皮轻度异常增生组与上皮单纯增生组外,其余各组中的差异均有统计学意义(P<0.05)。取正常舌黏膜组2-△△CT值为1,其余各病理分级组2-△△CT值分别为1.302817、1.566356、2.105200、4.657036、5.755607。即各病理分级组组织中Kv3.4 m RNA表达量分别是上皮正常组组织中Kv3.4 m RNA表达量的1.302817倍、1.566356倍、2.1052倍、4.657036倍、5.755607倍。5.EGFR m RNA在正常舌黏膜组△CT值的平均值为6.6724、上皮单纯增生组△CT值的平均值为6.088900,上皮轻度、中度、重度异常增生组△CT值的平均值为5.661000、4.970000、4.753000,上皮癌变组△CT值的平均值为4.223900。除上皮中度增生组与上皮重度异常增生组外,其余各组中的差异均有统计学意义(P<0.05)。取正常舌黏膜组2-△△CT值为1,其余各病理分级组2-△△CT值分别为1.49848、2.015866、3.254419、3.782657、5.458483。即各病理分级组组织中EGFR m RNA表达量分别是上皮正常组组织中EGFR m RNA表达量的1.49848倍、2.015866倍、3.254419倍、3.782657倍、5.458483倍。6.Caveolin-1 m RNA在正常舌黏膜组△CT值的平均值为5.565300,上皮单纯增生组△CT值的平均值为5.144400,上皮轻度、中度、重度异常增生组△CT值的平均值为4.891000、4.760900、4.223000,上皮癌变组△CT值的平均值为3.592800。除上皮轻度增生组与上皮单纯增生组、上皮轻度增生组与上皮重度组外,其余各组中的差异均有统计学意义(P<0.05)。取正常舌黏膜组2-△△CT值为1,其余各病理分级组2-△△CT值分别为1.338762、1.595822、1.746419、2.535552、3.924476。即各病理分级组组织中Caveolin-1 m RNA表达量分别是上皮正常组组织中Caveolin-1 m RNA表达量的1.338762倍、1.595822倍、1.746419倍、2.535552倍、3.924476倍。7.Kv3.4 m RNA、EGFR m RNA及Caveolin-1m RNA在舌黏膜癌变过程中表达趋势一致,采用Pearson相关分析:在舌黏膜癌变过程中,Kv3.4 m RNA的表达水平与EGFR m RNA呈正相关关系(r=0.616,P<0.05);EGFR m RNA的表达水平与Caveloin-1 m RNA呈正相关关系(r=0.893,P<0.05);Kv3.4 m RNA的表达水平与Caveloin-1 m RNA呈正相关关系(r=0.61,P<0.05)。结论:1.采用4NQO饮水法可以诱导SD大鼠舌黏膜癌变的发生,但诱导形成的TSCC主要为高分化的鳞状细胞癌。2.在SD大鼠舌黏膜癌变过程中,Kv3.4蛋白、EGFR蛋白、Caveolin-1蛋白阳性表达均发生了变化,且随着病理分级的增加,Kv3.4蛋白、EGFR蛋白、Caveolin-1蛋白的表达均上调。3.在SD大鼠舌黏膜癌变过程中,Kv3.4蛋白、EGFR蛋白、Caveolin-1蛋白在翻译水平发生了变化,且随着病理分级的增加Kv3.4 m RNA、EGFR m RNA、Caveolin-1 m RNA的表达量均呈逐渐增多的趋势,Kv3.4 m RNA和EGFR m RNA、Kv3.4 m RNA和Caveolin-1m RNA、EGFR m RNA和Caveolin-1 m RNA在舌黏膜癌变过程中的表达水平均呈正相关。4.联合检测大鼠舌黏膜癌变过程中的Kv3.4、EGFR和Caveolin-1的表达,将有助于探索舌鳞癌的发生发展机制,为舌鳞癌的靶向治疗提供新的思路和方法。