论文部分内容阅读
目的：探讨山药多糖对体外培养的胚鼠大脑皮层神经细胞毒性剂量，对缺氧/复氧性神经细胞活性影响及抗凋亡作用、以及抗凋亡机制，为山药多糖临床应用于防治脑缺血/缺氧疾病提供理论基础和实验依据，为中药多糖的开发和利用提供实验依据。方法：1、胚鼠大脑皮层神经细胞无血清培养。2、胚鼠大脑皮层神经细胞无血清缺氧/复氧培养。3、MTT法检测不同剂量的山药多糖对正常和缺氧/复氧培养的胚鼠大脑皮层神经细胞的刺激和毒性作用。4、实验分组：（1）正常对照组（Con.）：原代培养的神经细胞在37℃、5.0%饱和湿度CO2培养箱中连续培养6d；（2）阳性对照（凋亡诱导）组（Apo.）：原代培养的神经细胞在37℃、5.0%饱和湿度二氧化碳培养箱中培养4d后再缺氧培养12h复氧培养24h培养；（3）山药多糖干预组（CYPS）：原代培养的神经细胞在37℃、5.0%饱和湿度CO2培养箱中培养4d后，分别加入终浓度为0.025g/L（CYPS1组）、0.05g/L（CYPS2组）、0.1g/L（CYPS3组）、0.25g/L（CYPS4）山药多糖预处理4h后再缺氧培养12h复氧培养48h。5、Annexin V-FITC/PI荧光双染流式细胞仪测定实验各组神经细胞早期凋亡率、晚期凋亡率及坏死率。6、Hoechst33342荧光染色观察实验各组神经细胞凋亡形态变化及实验各组的细胞凋亡率。7、流式罗丹明-123（Rh-123）荧光染色检测实验各组神经细胞内线粒体损伤情况。8、核DNA琼脂糖凝胶电泳检测实验各组神经细胞凋亡晚期核DNA降解情况。9、RT-PCR半定量法检测实验各组神经细胞内Caspase-3、Bax和Bcl-2mRNA的相对表达。10、免疫细胞化学染色检测细胞NSE及GFAP阳性表达率，鉴定培养的神经细胞，以及实验各组神经细胞内Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白的阳性表达率。结果：1、体外培养6d的SD胚鼠大脑皮层神经细胞经抗NSE、GFAP抗体免疫细胞化学染色显示，细胞NSE阳性率为（93.7±0.56）%，而GFAP阳性表达率仅为（8.78±0.55）%。2、MTT法测定体外常氧培养的SD胚鼠大脑皮层神经细胞发现，山药多糖在0.05g/L0.5g/L的浓度范围内神经细胞生长活性较对照组显著升高（P<0.05），在1.0g/L4.0g/L的浓度范围内对神经细胞活性无显著影响（P>0.05），而当山药多糖浓度为8.0g/L时对神经细胞生长有明显地抑制作用（P<0.05）。3、MTT法测定经山药多糖预处理后缺氧/复氧培养的SD胚鼠大脑皮层神经细胞发现，各实验组较常氧培养正常对照组神经细胞生长活性明显降低（P<0.05），但山药多糖浓度在0.05g/L0.1g/L时显著地抑制缺氧/复氧诱导的神经细胞损伤（P<0.05），而在0.025g/L和0.25g/L1.0g/L之间对缺氧/复氧诱导的神经细胞损伤也有一定的保护作用，2.0g/L加重缺氧/复氧诱导的神经细胞损伤并与凋亡阳性组相同。4、Hochest33342荧光染色法分析经山药多糖预处理后缺氧/复氧培养的SD胚鼠大脑皮层神经细胞发现，山药多糖在0.025g/L0.25g/L各组凋亡率分别为（32.08±1.64）%、（26.74±0.45）%、（22.32±1.81）%、（28.54±0.79）%，均较凋亡阳性组（37.61±2.87）%明显下降（P﹤0.05），且较正常对照组（6.48±0.55）%凋亡率显著升高（P﹤0.05）。5、流式Annexin V-FITC/PI荧光双染法分析经山药多糖预处理后缺氧/复氧培养的SD胚鼠大脑皮层神经细胞发现，正常培养组、凋亡阳性组和CYPS1CYPS4组早期凋亡率分别为（2.46±0.58）%、（51.50±2.44）%、（36.67±2.53）%、（26.17±3.80）%、（13.87±2.67）%、（43.63±0.75）%。CYPS1～CYPS4组早期凋亡率较正常培养组明显升高（P<0.05），但较凋亡诱导组神经细胞凋亡率显著下降（P<0.05），且在0.05g/L0.1g/L浓度范围内神经细胞早期凋亡率随山药多糖浓度的增加而下降。而山药多糖对神经细胞晚期凋亡率和坏死率则无显著影响。6、流式罗丹明123（Rhodamine123）荧光染色法分析经山药多糖预处理后缺氧/复氧培养的SD胚鼠大脑皮层神细胞显示，缺氧的神经细胞线粒体损伤在正常培养组、凋亡阳性组和CYPS1～CYPS4组平均荧光强度分别为232.33±17.62，34.30±13.00，54.87±8.95，159.33±4.51，180.33±13.43，45.90±3.53；且山药多糖浓度在0.05g/L0.1g/L之间能显著抑制缺氧诱导的神经细胞线粒体损伤（P<0.05），证明山药多糖能够一定程度的减少缺氧对神经细胞线粒体损伤，并具有剂量依赖效应。7、琼脂糖DNA凝胶电泳分析经山药多糖预处理后缺氧/复氧培养的SD胚鼠大脑皮层神经细胞发现，山药多糖凋亡诱导组可以观察到明显的凋亡条带，而正常对照组及山药多糖0.1g/L组未见明显凋亡条带，其它组条带有所减弱。8、RT-PCR分析经山药多糖预处理后缺氧/复氧培养的SD胚鼠大脑皮层神经细胞发现缺氧的神经细胞Caspase-3、Bax和Bcl-2mRNA的表达在正常对照组、凋亡阳性组、CYPS1～CYPS4组表现出一定的变化，其Caspase-3mRNA的相对表达率分别为0.62±0.02，1.24±0.03，1.17±0.10，0.87±0.10，0.78±0.05，0.97±0.03；Bax mRNA的相对表达率分别为0.28±0.04，0.70±0.02，0.65±0.07，0.52±0.06，0.38±0.06，0.52±0.11；Bcl-2mRNA的相对表达率分别为0.88±0.13，0.49±0.09，0.45±0.06，0.67±0.01，0.71±0.05，0.63±0.11。山药多糖在0.1g/L0.25g/L之间能显著下调Caspase-3mRNA的表达，在0.05g/L0.25g/L范围内能显著下调Bax mRNA的表达，在0.05g/L0.1g/L范围内能显著上调Bcl-2mRNA的表达（P<0.05）。9、免疫细胞化学染色检测经山药多糖预处理后缺氧/复氧培养的SD胚鼠大脑皮层神经细胞发现缺氧的神经细胞凋亡蛋白Bax和Caspase-3与抗凋亡蛋白Bcl-2表达在正常对照组、凋亡阳性组和CYPS1～CYPS4组表现出一定变化，其Caspase-3蛋白阳性细胞率分别为37.03%±0.38%、58.89%±0.45%、55.65%±0.24%、53.54%±0.79%，45.76%±0.53%，52.42%±1.06%；Bax蛋白阳性细胞率分别为53.32%±0.77%，65.08%±1.02%，61.70%±2.12%，57.34%±2.53%，53.74%±1.72%，58.38%±1.11%；Bcl-2蛋白阳性细胞率分别为59.36%±2.23%，37.83%±1.08%，43.54%±0.93%，46.82%±0.63%，52.82%±1.33%，45.88%±1.38%。山药多糖在0.025g/L0.25g/L范围内能显著下调Caspase-3蛋白表达，在0.1g/L0.25g/L范围内能显著下调Bax蛋白表达，在0.05g/L0.25g/L范围内能显著上调Bcl-2蛋白的表达（P<0.05）。结论：1、SD胚鼠大脑皮层神经细胞无血清培养神经元含量达（93.7±0.56）%。2、山药多糖在0.05g/L0.5g/L的浓度范围内能显著提高神经细胞生长活性；在0.05g/L0.1g/L的浓度内能显著地抑制缺氧/复氧诱导的神经细胞损伤。3、山药多糖在0.025g/L0.25g/L的范围内能显著抑制神经细胞早期凋亡凋亡；在0.025g/L0.25g/L的浓度内能显著抑制缺氧/复氧诱导的神经细胞线粒体损伤。4、山药多糖在0.1g/L0.25g/L的浓度内能显著下调缺氧/复氧诱导的神经细胞Caspase-3mRNA的表达，在0.05g/L0.25g/L浓度内能显著下调Bax mRNA的表达，在0.05g/L0.1g/L浓度内能显著上调Bcl-2mRNA的表达；在0.025g/L0.25g/L浓度内能显著下调Caspase-3蛋白表达，在0.1g/L0.25g/L浓度内能显著下调Bax蛋白表达，在0.05g/L0.25g/L浓度内能显著上调Bcl-2蛋白的表达。5、山药多糖抗缺氧性凋亡可能是通过下调Caspase-3和Bax凋亡基因和蛋白表达，上调Bcl-2抗凋亡基因和蛋白表达，提高Bcl-2/Bax蛋白比例而产生生物学效应。