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研究背景：目前普遍认为，约有70%的出生缺陷是由环境因素与遗传因素共同作用的结果。由于胚胎发育对外界环境特别敏感，因而母源性因素对胚胎发育的影响一直是研究出生缺陷的主要角度。而对于父源性出生缺陷的研究却没有给予应有的重视。随着社会经济的发展，环境污染、不良生活习惯等各种环境因素使人类精液质量不断下降，而精液质量的持续下降很有可能提高父系出生缺陷的发生率。双酚A（BPA）是一种人类普遍暴露的环境内分泌干扰物。据报道能对动物体和人体的神经系统、免疫系统、内分泌系统、生殖系统等产生不良影响。双酚A可通过多种机制作用于多种靶器官发挥生物学效应。BPA除了能够结合经典的雌激素受体ERα和ERβ，还能通过G蛋白偶联的膜雌激素受体GPR30的非基因组途径迅速发挥作用；此外，BPA的作用还涉及表观遗传学机制。高剂量的双酚A对雄性生殖系统有害，特别是在组织器官形成和发育阶段的暴露能对实验动物造成生殖功能的危害，并且可以持续到成年期；低剂量BPA对雄性生殖系统的危害还存在着争议。BPA对子代生殖功能的影响目前也没有明确的结论，双酚A对精子的表观遗传修饰作用如DNA甲基化，组蛋白甲基化等的影响及其在传代中的意义都是有待研究的科学问题。研究目的：建立BPA引起精子异常而导致F1子代雄性生殖出生缺陷的小鼠模型，揭示BPA暴露小鼠精子的表观遗传学特征，初步揭示BPA引起精子异常与子代生殖缺陷的表观遗传学基础。方法：首先建立BPA雄性小鼠的暴露和传代模型。高剂量BPA以50mg/kg/day的剂量腹腔注射3周龄雄性C57BL/6J小鼠7天，5周后取样及繁殖，与6周龄正常雌性小鼠繁殖产生F1代，F1代雄性小鼠再与正常雌性小鼠繁殖产生F2代。检测F0、F1、F2代雄鼠精子数量、精子形态和睾丸组织形态学。抽提F0代小鼠精子DNA，MeDIP富集甲基化DNA后进行高通量测序及生物信息学分析，建立BPA暴露的小鼠精子DNA甲基化谱，并挑选差异甲基化基因和印记基因进行验证。分离F1代小鼠的精原细胞进行mRNA表达谱芯片检测和生物信息学分析，建立BPA暴露的F1代小鼠精原细胞表达谱。进行甲基化谱与表达谱的负相关分析。通过定量PCR技术、Westernblot、免疫组化等技术，检测BPA对DNA甲基化转移酶mRNA水平、组蛋白甲基化水平的影响。低剂量BPA暴露分别以5μg/kg/day、50μg/kg/day的剂量灌胃给药3周龄C57BL/6J雄性小鼠5周，与6周龄正常雌性小鼠繁殖产生F1代。利用DNA甲基化结合蛋白MBD方法富集小鼠精子甲基化DNA，结合荧光定量PCR方法检测Tnnt2、Tectb等基因甲基化水平的相对变化；Western blot检测F1代小鼠精子中组蛋白甲基化水平变化。利用小鼠精原干细胞C18-4细胞，体外研究BPA对小鼠精原干细胞增殖及表观遗传机制的影响。结果：1、高剂量BPA暴露对雄性小鼠及其子代的生精功能有不良影响。高剂量BPA引起F0代小鼠精子数量下降20.6%（P<0.01），F1代小鼠精子数量下降12.1%（P<0.05），F2代小鼠精子数下降9.2%（P>0.01）。高剂量BPA暴露引起F0代小鼠精子畸形率增加了9.65%（P <0.05），对F1、F2代小鼠精子畸形率没有明显影响（P>0.05）。高剂量BPA暴露能引起F1代出生性别比增加（P <0.05）。2、F0代精子甲基化DNA高通量测序共筛选出1597个差异基因，其中BPA引起的低甲基化基因有1112个，占69.6%；高甲基化基因有379个，占23.7%；106个基因部分低甲基化，部分高甲基化。经进一步验证，F0代BPA组小鼠精子中印记基因Gtl2、H19、Igf2r、Kcnq1、Gnas、Impact、Lit1、Nespas、Mest、Peg3、Peg10、Snrpn甲基化水平与对照组没有统计学差异（P>0.05）；BPA组小鼠精子中Magef1基因启动子区甲基化水平显著增加（P<0.01）；BPA暴露组F0、F1两代小鼠精子中Tnnt2基因分别与对照组相比，甲基化水平都发生下降，而Magef1基因的甲基化水平相对增加。高剂量BPA暴露导致F0代小鼠睾丸和精子整体DNA甲基化水平下降，睾丸中组蛋白H3K9Me3表达水平增加。3、F1代小鼠精原细胞表达谱检测共得到2091个差异基因，BPA引起上调的基因有1546个，下调的基因545个。共有101个基因在精子DNA甲基化与精原细胞mRNA表达之间具有负相关性。4、50μg/kg低剂量BPA暴露引起小鼠精子数量显著下降20.1%（P<0.01），而5μg/kg低剂量BPA暴露对精子数量没有影响（P>0.05）。两组低剂量BPA暴露对小鼠生殖器官脏器指数不产生明显影响（P>0.05），但50μg/kg BPA能引起每胎产仔数减少（P<0.05）。50μg/kg BPA能引起睾丸中的Tnnt2、Tectb基因甲基化水平发生变化。50μg/kg BPA能引起F1代小鼠精子中组蛋白H3K9Me3水平下降，H3K27Me3、H3K36Me3水平显著增加。5、10-9M-10-6M BPA能促进精原干细胞C18-4细胞增殖（P<0.05）；10-5M BPA能显著抑制细胞生长（P<0.01）；10-5M BPA引起C18-4细胞凋亡率明显增加（P<0.01），基因组整体DNA甲基化水平显著下降50%（P<0.01），H3K27Me3，H3K36Me3的表达水平显著下降（P<0.01）。结论：（1）青春期雄性小鼠短暂地暴露于高剂量BPA，能对成年后及其F1子代的生精功能产生不良影响。高剂量BPA能引起F0代小鼠睾丸和精子总体DNA甲基化水平下降；F0代小鼠睾丸组蛋白H3K9Me3水平增加。BPA暴露引起F0、F1两代小鼠精子中Tnnt2基因甲基化水平发生相对下降、而Magef1基因甲基化水平相对增加。（2）50μg/kg/day低剂量BPA对小鼠生精功能产生不良影响，引起F1代小鼠精子组蛋白甲基化水平变化。（3）BPA对小鼠精原干细胞C18-4细胞增殖具有非单调剂量效应，10-5M高剂量BPA能影响整体DNA甲基化和组蛋白甲基化水平。