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赤藓糖醇(Erythritol)是一种具有热稳定性好、甜度较低、零热值、无吸湿性、不产生龋齿的天然高附加值的四碳多元醇填充型甜味剂,在自然界中广泛存在。可用于低热值食品、糖尿病人食品及各种保健食品、糖果、巧克力、乳酸菌饮料等产品中,由于其食用安全性高,市场需求量也逐年增大,因此如何能开发出更高产的菌株是目前研究的关键内容。赤藓糖醇的生产主要是通过耐高渗酵母发酵经磷酸戊糖途径发酵获得。赤藓糖醇先通过糖酵解,使大部分碳转化成足够多的还原力,以供给赤藓糖醇的生成,再分泌到细胞外。由于赤藓糖还原酶是催化该反应的最终酶,直接作用于赤藓糖醇的生成,因此被认为是关键酶。至今为止对于赤藓糖还原酶的研究相对较少,对于大多数赤藓糖醇产生菌来说,赤藓糖还原酶的编码基因仍然是未知的。现今已报道的产赤藓糖醇的酵母菌中,仅有Trichosporonoides megachiliensis SNG-42中的er 1,er 2,er 3分别编码赤藓糖还原酶ER-Ⅰ,ER-Ⅱ,ER-Ⅲ和Candida magnoliae JH110中的一个赤藓糖还原酶基因被识别。本研究所选菌株为耐高渗酵母球头三型孢菌(Trichosporonoides oedocephalis ATCC16958),虽然经过优化培养,该菌株赤藓糖醇产量有所提高,但其产量仍然难于达到规模化生产的标准,因此本研究希望通过基因工程的手段进行改造,使其在原核菌中成功表达,进而提高其产量。通过克隆该菌株的赤藓糖还原酶基因(ER),再将此基因转化到E.coli BL-21(DE3)中,成功的进行诱导表达,为赤藓糖醇的规模化生产提供良好的菌种,并为后续如何进一步研究赤藓糖还原酶的活性及三维空间建模等提供优良的基因模板,进而从根本上提高糖醇的产量奠定理论基础。本课题的主要研究内容如下:(1)克隆载体的构建:通过Primer 5.0软件分析GeneBank中发表的设计赤藓糖还原酶的基因序列,从现有菌株中获取赤藓糖还原酶基因,完成关键酶基因的亚克隆,获得关键功能基因序列(ER),连接到克隆载体pMD18-T上,获得克隆菌株pM-ER。(2)原核表达载体的构建:进一步将克隆得到的酶基因连接到原核表达载体PET-28a(+)上,构建原核基因重组质粒(pE-ER),转化到大肠杆菌BL21(DE3)的感受态菌株中,建立表观筛选方法,完成测序,获得表达菌株pE-ER。(3)表达:通过诱导剂IPTG的诱导,再经SDS-PAGE及Western Blotting的分析鉴定,来证明所构建的重组表达菌株pE-ER。