LncRNA-HOTAIR对肝癌细胞增殖、侵袭转移和凋亡的机制研究

来源 :吉林大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:xiaoxiaoDang
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根据2018年全球癌症统计的分析报告得知,肝癌的发病率位列第六,死亡率位列第四。肿瘤转移,肝内频繁繁殖和肝外进展是肝癌患者预后不良的主要原因。在过去的20年中,尽管临床治疗和保肝护肝药物取得了长足的进步,但肝癌患者的生存质量在很大程度上受到癌症复发和癌症转移的威胁。基因组研究的进展增加了我们对肝癌发病机制的了解,肝癌发生发展的遗传事件可分为基因组(体细胞突变和基因组结构变化,例如基因融合或拷贝数变异),表观遗传(甲基化乙酰化修饰,染色质重塑,微小R NA和长非编码RNA)和基因转录异常。长链非编码RNA-HOTA IR在肝癌细胞中高表达,并作为调节肿瘤侵袭和转移的重要分子引起越来越多的关注。目前,肝癌检测的临床生物标志物尚不明确,但多变量分析显示,HOTAIR是预测肝癌患者总体生存期的独立预后因素,这表明HOTAIR可能是肝癌进展的潜在生物标志物。因此,阐明HOTAIR调控肝癌细胞增殖,侵袭转移,凋亡等方面的分子机制对于肝癌的早期预防,诊断以及靶向治疗具有借鉴意义。上皮间充转化(epithelial to mesenchymal transition,EMT)过程通过赋予癌细胞迁移和侵袭能力,成为肿瘤转移扩散的驱动因素,普遍认为EMT是肿瘤细胞具备侵袭转移能力的关键转换。EMT过程中上皮标志物E-cadherin的表达降低导致细胞粘附能力丧失,随后导致细胞解离,运动性和侵袭性增加。在此过程中,一系列EMT转录因子(EMT transcriptional factors,EMT-TF)包括Snail1,Snail2,ZEB1,ZEB2和Twist等通过抑制上皮基因的转录并激活间充质基因参与调控EMT,但具体的机制不明。除EMT过程外,临床和流行病学研究还显示了一些酶促生物标志物,例如基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)在肿瘤侵袭,新血管生成,肿瘤转移中发挥重要作用,MMPs作为锌依赖性蛋白水解酶,通过降细胞外基质(extracellular matrix,ECM)和基膜来赋予肿瘤细胞侵袭转移能力。其中,MMP2和MMP9通过降解基底膜的IV型胶原,为肿瘤细胞的侵入提供驱动力。细胞凋亡在细胞命运和组织稳态中起着至关重要的作用。先前的研究表明,靶向线粒体家族的micro RNA,死亡受体介导的信号通路和药物诱发的自噬可在肝癌细胞中诱导细胞凋亡的发生。较少的研究关注长链非编码RNA在线粒体诱导的细胞凋亡中的作用。根据De Paepe B的研究,HOTAIR已成为调控线粒体诱导凋亡的有效调节剂。其中,Bcl-2家族蛋白在内源性/线粒体途径的凋亡途径中发挥重要作用。Bcl-2家族蛋白按功能可分为促凋亡蛋白、抗凋亡蛋白以及BH3-only蛋白。“激活因子”(BIM和BID)通过诱发效应因子Bax和Bak结构变化并使其激活,激活的BaxBak在线粒体外膜自身寡聚化形成通道,触发线粒体外膜的通透性转化(MOMP),导致细胞凋亡。基于以上实验背景,我们试图通过靶向HOTAIR介导的线粒体诱导的细胞凋亡途径为肝癌的治疗提供参考。目的:通过探讨LncRNA-HOTAIR对肝癌细胞增殖,侵袭转移和凋亡生物学行为的影响,阐明LncRNA-HOTAIR参与调控的生物学行为对肝癌进展的重要性,为寻找肝癌的临床生物学标志物做初步探索。实验方法:1.q-PCR检测不同类型肝癌细胞中HOTAIR的基础表达量,选择理想的实验细胞株。2.实时无标记动态细胞分析(Real Time Cell Analysis,RTCA)检测HOTAIR对肝癌细胞(Hep G2,SNU-387)生长状态的影响;克隆形成实验检测HOTAIR对肝癌细胞(Hep G2,SNU-387)增殖能力的影响。3.Transwell(Matrigel-)以及划痕实验分别检测HOTAIR对肝癌细胞(Hep G2,SNU-387)垂直方向和水平方向迁移能力的影响;Transwell(Matrigel+)检测HOTAIR对肝癌细胞(Hep G2,SNU-387)侵袭能力的影响。4.Western blot和q-PCR分别检测HOTAIR对肝癌细胞(Hep G2,SNU-387)侵袭转移和凋亡相关通路的分子在蛋白水平和转录水平的变化。5.细胞免疫荧光技术以及细胞核/浆蛋白分离试剂盒检测HOTAIR对上皮间质转化过程中转录因子Snail2核内表达量的影响。免疫荧光Hoechst染色检测HOTAIR对肝癌细胞凋亡发生过程中细胞(Hep G2,SNU-387)核形态的变化。6.流式细胞术检测HOTAIR对肝癌细胞(Hep G2,SNU-387)凋亡和线粒体膜电势变化的影响。7.TCGA数据库分析HOTAIR和E-cadherin(CDH1)以及HOTAIR和Snail2在m RNA转录水平的相关性。实验结果:1.与肝正常细胞(changliver)相比,五种肝癌细胞系中,Hep G2细胞中HOTAIR的基础表达量最高(4.2倍),其次是SNU-387(3.5倍)。2.过表达HOTAIR(LZRS-HOTAIR)组SNU-387细胞的增殖速率较CON组加快,细胞倍增时间缩短。sh-HOTAIR组中Hep G2,SNU-387细胞的增殖速率较sh-NC组减慢,倍增时间延长;此外,过表达HOTAIR(LZRS-HOTAIR)组SNU-387细胞克隆能力较CON组增强;sh-HOTAIR组Hep G2,SNU-387细胞的克隆能力较sh-NC组减弱。3.过表达HOTAIR(LZRS-HOTAIR)组SNU-387细胞的侵袭迁移能力较CON组增强;sh-HOTAIR组Hep G2,SNU-387细胞的侵袭迁移能力较sh-NC组减弱。4.与CON组相比,过表达HOTAIR后,SNU-387细胞中MMP2和MMP9在蛋白和m RNA转录水平均明显上升;上皮细胞标志物E-cadherin的表达量在蛋白和m RNA转录水平均明显降低;间质标志物N-cadherin在蛋白水平明显上调,m RNA转录水平无明显变化;Snail2在蛋白和m RNA转录水平均明显上升。与sh-NC组相比,sh-HOTAIR组Hep G2和SNU-387细胞中,MMP2和MMP9在蛋白和m RNA转录水平均显著降低;Hep G2细胞sh-HOTAIR组中E-cadherin在蛋白和m RNA转录水平明显上升;N-cadherin仅在蛋白水平明显降低,转录水平无明显变化;Snail2在蛋白和m RNA转录水平明显降低。SNU-387细胞sh-HOTAIR组中E-cadherin在蛋白和m RNA转录水平均明显上升;N-cadherin和Snail2在蛋白水平明显降低,转录水平均无明显变化;与Con组相比,SNU-387细胞过表达HOTAIR组中Snail2核内表达量增加,荧光强度增强。与sh-NC组相比,Hep G2和SNU-387细胞sh-HOTAIR组中Snail2核内表达量减少,荧光强度减弱。5.sh-HOTAIR组中Hep G2和SNU-387细胞的线粒体膜电势较sh-NC组明显降低,细胞凋亡率明显增加。线粒体促凋亡蛋白Bak表达量增加;线粒体抗凋亡蛋白Bcl-2,Mcl-1表达量降低。6.与sh-NC组相比,sh-HOTAIR组中Hep G2和SNU-387细胞中可观察到核染色质凝集,核固缩,部分出现核碎裂等异常核形态。7.TCGA数据库分析HOTAIR和E-cadherin(CDH1)m RNA转录水平没有明显的负向调控关系;HOTAIR和Snail2的m RNA转录水平没有明显的正向调控关系。.实验结论:1.HOTAIR在五种肝癌细胞系中的基础水平表达量高于肝正常细胞。2.HOTAIR促进肝癌细胞增殖,缩短其倍增时间。3.HOTAIR通过调控上皮间质转化过程中转录因子Snail2的细胞核定位,以及对基质金属蛋白酶MMP2和MMP9的调控,促进肝癌细胞的侵袭转移。4.敲低HOTAIR可诱导肝癌细胞发生线粒体诱导的细胞凋亡。5.针对TCGA数据库,HOTAIR与E-cadherin(CDH1)以及HOTAIR与Snail2在转录水平上无明显的相关性。
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