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背景和目的多囊卵巢综合征（Polycystic ovary syndrome,PCOS）是一种以高雄激素血症、稀发排卵或不排卵和卵巢多囊样形态为特征的疾病。PCOS患者以稀发排卵或不排卵为主要症状,经常伴有肥胖、胰岛素抵抗（Insulin resistance,IR）、代偿性高胰岛素血症、高脂血症等代谢紊乱。PCOS的病理生理机制是复杂的,发育、环境、遗传和表观遗传机制都参与其中。引起PCOS卵泡发育异常的原因也是复杂的、多因素的。卵巢颗粒细胞（Granulosa cells,GC）的增殖和分化对于卵泡发育至关重要。在卵母细胞的发育过程中,卵母细胞与GC相互影响,异常的GC增殖导致异常的卵泡发育及排卵,是PCOS患者卵泡发育异常的主要原因之一,但其具体的发病机制仍需要深入探讨研究。微小RNA（microRN,miRNA）是一类小的非编码内源性分子,长度为18-22个核苷酸。MiRNA可以通过与目标mRNA的3’非翻译区（Untranslated region,UTR）结合,从而抑制目标mRNA翻译过程或降解目标mRNA,参与基因转录和转录后表达调控。单个miRNA可以调节各种靶基因的功能和表达,并且通过调节反馈机制对miRNA信号作用进行放大,从而影响多种生物学过程。MiR-664a-3p位于RAB3GAP2的内含子中,与肿瘤细胞增殖相关,但其在PCOS中的作用尚未明确。本研究旨在明确miR-664a-3p在PCOS患者以及在KGN细胞中的表达及其对KGN细胞增殖的影响,并揭示其潜在的分子机制,为PCOS提供潜在的诊断生物标志物或治疗靶标。方法1.生信分析miR-664a-3p在PCOS颗粒细胞及KGN细胞中的表达及作用检索并下载基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus database,GEO）中PCOS相关的miRNA数据集GSE68285和GSE72274,用于分析miRNA的表达。qRT-PCR实验进一步在人正常卵巢上皮细胞IOSE80和KGN细胞中检测miR-664a-3p的表达,和生物信息学的结果互为验证。在KGN细胞中过表达miR-664a-3p或抑制其表达后,分别用qRT-PCR检测相关基因的mRNA。同时用Cell counting kit-8（CCK-8）试剂盒和克隆形成实验检测细胞增殖能力,用流式细胞术和免疫印迹（Western blotting,WB）检测细胞周期和凋亡情况。2.MiR-664a-3p通过靶向BCL2A1影响KGN细胞增殖及凋亡利用TargetScan和miRWalk网站预测miR-664a-3p可能的靶基因,并利用miRWalk在线富集工具对靶基因进行GO和KEGG分析,与BCL2A1的潜在结合位点,并构建BCL2A1-3’UTR-WT/MT报告基因,采用qRT-PCR、WB和双荧光素酶报告基因法进一步验证miR-664a-3p与BCL2A1的结合。检索并下载GSE168404,GSEA分析BCL2A1表达水平与细胞增殖、周期、凋亡以及MAPK信号通路的关系。恢复BCL2A1蛋白水平后,采用上述方法进一步检测miR-664a-3p对KGN细胞增殖、细胞周期、克隆形成及凋亡的影响是否被逆转。随后我们还采用WB的方式,联合恢复BCL2A1水平,检测了miR-664a-3p对MAPK/ERK信号通路激活的影响。结果1.MiR-664a-3p在PCOS卵巢颗粒细胞及KGN中低表达,并抑制KGN细胞增殖,抑制KGN细胞周期和促进KGN细胞凋亡下载PCOS miRNA数据矩阵GSE68285和GSE72274并合并数据,分析miR-664a-3p的表达。我们发现与对照组相比,miR-664a-3p在PCOS的颗粒细胞中表达降低（P＜0.001）。与人正常卵巢上皮细胞IOSE80相比,qRT-PCR检测到miR-664a-3p在KGN细胞中表达水平明显降低。MiR-664a-3p可抑制KGN细胞增殖,抑制miR-664a-3p表达,则促进KGN细胞增殖（P＜0.05）。细胞周期结果显示,过表达miR-664a-3p可使G0/G1期细胞数量增加,S期细胞数量减少（P＜0.05）,抑制细胞周期。与此同时,WB结果显示过表达miR-664a-3p后,细胞周期相关蛋白--细胞周期蛋白依赖激酶2（Cyclin-dependent kinase 2,CDK2）和细胞周期蛋白B1（CyclinBl,CCNB1）的表达下调（P＜0.05）。抑制miR-664a-3p的表达则促进细胞周期。流式细胞术结果表明,转染miR-664a-3p mimic后,KGN细胞的凋亡率增加（P＜0.05）。WB结果也表明:BCL2表达降低且Bax表达增强（P＜0.05）。反之,转染miR-664a-3p inhibitor后细胞凋亡能力受抑制（P＜0.05）。2.MiR-664a-3p通过靶向BCL2A1抑制KGN细胞增殖并促进KGN细胞凋亡的发生双荧光素酶报告基因实验结果表明,与NC组细胞相比,转染BCL2A1-3’UTR-WT的KGN细胞荧光信号最弱（P＜0.05）,而转染BCL2A1-3’UTR-MT则不改变KGN细胞荧光强度,即BCL2A1可与miR-664a-3p结合。在KGN细胞中过表达BCL2A1后,miR-664a-3p对KGN细胞增殖和周期的抑制作用及对KGN细胞凋亡的促进作用均被逆转。表明miR-664a-3p通过结合并阻碍靶基因BCL2A1的翻译进而影响KGN细胞的增殖和凋亡。MAPK/ERK信号通路结果提示,miR-664a-3p通过阻碍靶基因BCL2A1的翻译进而抑制MAPK/ERK信号通路的激活促进PCOS发生发展。结论1.MiR-664a-3p在PCOS患者颗粒细胞中表达下调。2.MiR-664a-3p抑制人卵巢颗粒细胞增殖和细胞周期,促进细胞凋亡。3.MiR-664a-3p通过靶向BCL2A1抑制人卵巢颗粒细胞增殖并促进凋亡的发生。