研究背景及目的 血管平滑肌细胞(VSMC)具有收缩和合成功能，传统观点认为两种功能由相同均一的VSMC完成，因为VSMC本身具有收缩和合成表型的双向调节能力。然而，这种观点已受到挑战，因为没有任何证据可以证明成人合成表型的VSMC具有收缩能力。随着对VSMC多样性研究的进展，产生了“选择性VSMC扩增”观点，即VSMC的不同功能由不同细胞亚群来完成，在某种病理或刺激情况下，某一功能状态的细胞亚群可通过直接克隆扩增而实现，而不需表型转换。但是，从动脉壁整个VSMC群中分离出某种单一的细胞亚群很困难，对于人VSMC亚群的功能研究更未见报道。因此，对VSMC实现不同功能的机制出现了争议。本研究目的是：(1)克隆出体外能稳定传代，维持原有生物性状的VSMC系。(2)验证VSMC系表型转换特征，体外诱导VSMC实施收缩功能。(3)探讨表型转换过程中不同表 第四军医大学硕d：论文 中文摘要 型的特点及生长因子与Pl－1表达之间的变化c 实验方法（1）通过克隆成人＊S＊C，建立＊S＊C从非收缩型到收缩型之间 表型可逆转换模型：①将己建立的稳定的＊S＊C克隆株，分为3组，含 10％FBS组、去血清组及恢复10％血清组。探讨细胞特征与表型转换的相互 关系：①VSMC形态变化的评价c②细胞增殖和 DNA合成的测定，生长因 子PDGFEB作用VSMC后促细胞增殖和移行的反应，并观察PDGF－BB的 不同剂量和作用时间的关系。其中细胞增殖采用细胞计数法、DNA合成采用 ［h卜TdR参入法、细胞移行通过刮伤试验来评价。③蛋白质合成分析利用 ［＊－亮氨酸参入法。④血管收缩剂组胺和血管紧张素11刺激细胞收缩反应， 通过长度和面积的测量评价收缩功能，再分别以血管收缩剂的拈抗剂苯海拉 明和络沙坦阻断后，观察收缩反应是否受到抑制进一步验证VSMC收缩反 应。⑤通过Western blot观察收缩蛋白及收缩调节蛋白的表达，包括平滑肌 口．actin、平滑肌－MHC白同源体SM；和 SM。、calponln、h－caldesmon及 meta。，inculin。（3）PDGFEB作用＼／SMC后PAI－l表达变化，通过PDGFEB 的不同剂量和作用时间观察P＊＊卜＊B和PAl－1之间时效与量效关系c 实验结果（）成功地克隆了在体外能稳定传代，维持原有生物性状的VSMC 系一HITBS细胞株。HITBS细胞于体外可以实现收缩和非收缩表型的转换， 通过收缩功能证明VSMC由合成型转化成收缩型。（2）HffBS细胞株本身固有 的生物学特征是在血清中没有收缩能力，以一种未分化的合成表型存在；去 血清72h后则转换成有收缩能力的收缩表型。（3）去血清诱导HITBS由合成表 型向收缩表型转换的过程中其结构及功能变化主要表现在：①形态上：单个 ·3· 第四军医大学硕士论文 中文摘要 细胞更细长，折光性更强，而细胞群形成类似VSMC组织的浓密、多层的细 胞束；这种形态可维持ZW，恢复血清后Zd，HITBS再恢复伸展状态，细胞 束解散，失去有组织的形态，与去血清前比较无差异，提示去血清可诱导 HITBS呈现合成型向收缩型的形态学转变。②去血清后的HITBS细胞不增 殖，［＊丁dR参入率趋于 0，说明 DNA合成停止，同时细胞内可溶性蛋白和 ECM蛋白合成减少；但重新恢复血清后细胞增殖和［3H卜TdR参入率迅速增 加c除ECM蛋白尚未完全恢复外，其它观察指标均完全恢复原有基础水平， 提示去血清使HITBS 失去增殖、合成及分泌功能。同时发现去血清后的 HITBS对PDGF的促增殖和移行作用应答减弱，但去血清不影响HITBS的存 活能力。③血管收缩剂可引起HITBS产生收缩反应，组胺或血管紧张素＊刺 激后细胞面积和长度均明显减少，而应用两者的桔抗剂苯海拉明或络沙坦阻 断后，则抑制了这种收缩反应；相反，经血清培养的HITBS被组胺或血管紧 张素11刺激后细胞面积和长度变化均不明显，说明去血清可诱导HITBS转变 成收缩表型、出现功能的变化。④去血清后的收缩型和有血清的合成型HITBS 均表达特异性收缩蛋白，包括平滑肌0－。以1n、平滑肌－＊＊C的同源体＊MI 和 SM。。calponln、h－caldesmon及meta。，inculin，但去血清 后勺收缩型HITBS 表达量较有血清的合成型中等度增加，同时血管收缩剂作用产生收缩反应， 后者缺乏这种反应。（4）在HITBS向收缩表型转换中，PAI－1的合成增多，而 且可被PDGF－