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研究背景:骨吸收和骨形成的动态平衡维持着骨稳态。当机体处于炎症状态时,免疫细胞参与骨稳态的调节,产生细胞因子影响骨吸收和骨形成之间的平衡,其中TNF-α作为经典的促炎因子,可以促进破骨细胞分化,同时抑制成骨细胞的活性和功能。长期的炎症刺激（如骨质疏松症等）会引起骨量减少,增加骨的脆性。CCN2和JAK2信号通路参与多种生理和病理过程,在炎症环境中也起着重要作用。成骨细胞在炎症环境中的存活能力可以直接影响其分化功能。有研究表明CCN2和JAK2信号通路可以保护肿瘤细胞,增加细胞的凋亡抗性。探究CCN2和JAK2信号通路对细胞的保护作用是否也存在于成骨细胞中,CCN2和JAK2信号通路之间又存在着何种关系,对于控制炎症和维持骨稳态有着积极的意义。研究目的:通过获得和丧失功能的方式,探究CCN2和JAK2信号通路在TNF-α引起MC3T3-E1细胞凋亡中的作用和可能机制,并对CCN2和JAK2的上下游关系进行探索。材料和方法:1.通过流式细胞术、Western Blot和免疫荧光技术检测TNF-α引起MC3T3-E1细胞的凋亡和自噬作用,以及CCN2和p-JAK2的表达变化。2.应用慢病毒转染,构建过表达CCN2的MC3T3-E1细胞系。在此基础上利用Western Blot检测过表达CCN2对于TNF-α引起的凋亡和自噬的影响。并使用自噬的抑制剂CQ探索CCN2是否通过自噬作用对细胞进行保护。Akt和Erk通路的激活水平也通过Western Blot进行了检测,以探究这两个通路是否参与了过表达CCN2对细胞的影响。此外,我们进行了碱性磷酸酶活性、茜素红染色和矿化蛋白的检测来观察过表达CCN2对炎症环境中MC3T3-E1矿化能力的影响。3.使用AG490抑制JAK2信号通路,通过流式细胞术和Western Blot检测JAK2通路被抑制对MC3T3-E1细胞凋亡和自噬的影响。利用rapamycin和CQ分别激活和抑制自噬作用,用Western Blot检测凋亡相关蛋白探究JAK2通路是否通过自噬对细胞的凋亡产生作用。STAT3,Akt和Erk通路的激活水平也用Western Blot进行了检测,以观察JAK2被抑制后对信号这些通路的影响。4.利用si RNA技术降低MC3T3-E1细胞中CCN2的表达,结合CCN2过表达细胞系,通过Western Blot检测炎性环境下JAK2的激活水平,探究CCN2对JAK2信号通路的影响。用AG490抑制JAK2通路,Western Blot检测凋亡和自噬相关蛋白进一步探索CCN2和JAK2的上下游关系。结果:1.TNF-α可以增加MC3T3-E1的凋亡细胞比,凋亡相关蛋白的表达随着TNF-α浓度和作用时间的增加而增加,而LC3II/LC3I则在TNF-α作用12小时之后才开始增加,当TNF-α作用72h时LC3B的荧光强度显著高于对照组。CCN2的表达在TNF-α作用过程中减少了,而p-JAK2的表达则增加了。2.Lv CCN2组中CCN2的表达高于Lv NC说明CCN2过表达体系成功构建。过表达CCN2降低了TNF-α刺激后Cl-PARP和Cl-casp3的水平,同时上调了LC3II/LC3I的比例,自噬抑制剂CQ的预处理增加了Lv CCN2组中Cl-casp3的表达。P-Akt和p-Erk在TNF-α作用后均有上调,Lv CCN2组中p-Akt和p-Erk的水平高于对照组,抑制Akt和Erk通路可下调Lv CCN2细胞中LC3II/LC3I的比例,增加Cl-casp3的水平。TNF-α可以降低MC3T3-E1细胞的ALP活性、矿化结节形成以及Runx2和Osx的表达,过表达CCN2可以减弱TNF-α对ALP活性、矿化结节形成以及Runx2和Osx的抑制。3.AG490抑制JAK2通路增加了TNF-α作用下MC3T3-E1细胞中p62的表达,降低了LC3II/LC3I的比例,而凋亡标志蛋白Cl-PARP的水平则升高了。利用Rapamycin增加自噬水平可以抑制AG490引起的凋亡增强作用,而CQ抑制自噬则进一步增加了Cl-PARP的水平。AG490还可以降低p-STAT3,p-Akt和pErk的表达水平。4.过表达CCN2可以增加TNF-α引起的JAK2磷酸化,降低CCN2水平可以减少p-JAK2的表达水平。AG490抑制JAK2通路可以增加Lv CCN2细胞在TNF-α刺激下的Cl-PARP水平,降低LC3II/LC3I的比例。结论:1.TNF-α可以引起MC3T3-E1细胞凋亡和自噬,CCN2和JAK2通路可能参与其中。2.过表达CCN2可以通过增强自噬作用从而减少TNF-α引起的MC3T3-E1细胞凋亡,Akt和Erk信号通路也参与其中。过表达CCN2还可以挽救TNF-α对MC3T3-E1细胞矿化能力的抑制作用。3.AG490抑制JAK2通路可以减弱自噬作用从而增强TNF-α引起的MC3T3-E1细胞凋亡。STAT3,Akt和Erk通路均可因JAK2的抑制而影响。4.在TNF-α作用MC3T3-E1细胞过程中,JAK2是CCN2的下游通路。