丙酮酸广泛应用于医药、农用化学产品和食品工业。丙酮酸的制备方法有化学合成法、发酵法和生物酶法。酶法与其他生产方法相比,其底物(DL-乳酸或L-乳酸)来源丰富、生物转化效率高、反应条件温和、生产成本低、无污染。L-酪氨酸是人体必需氨基酸之一,用作日常食品添加剂,也是合成各种化学和医药产品的重要前体。根据目前文献报导L-酪氨酸的制备方法主要有提取法、化学合成法、直接发酵法和酶转化法。相比较于化学合成法,用生物法制备L-酪氨酸成本更低,绿色环保。酪氨酸酚裂解酶可以催化苯酚、丙酮酸和氨生物合成L-酪氨酸,利用酶法合成L-酪氨酸是近年氨基酸工业研究的热点之一。本文利用基因工程技术,在原核表达系统中分别重组表达了乳酸氧化酶、过氧化氢酶和酪氨酸酚裂解酶,并对多酶偶联体系酶法合成丙酮酸或L-酪氨酸进行了探索。1、构建了具有乳酸氧化酶活性的基因工程菌DM-2415 [pETDuet-lod/ BL21(DE3)],并优化了乳酸氧化酶催化DL-乳酸制备丙酮酸的反应条件。结果表明：(1)乳酸氧化酶重组表达成功,该酶可以催化DL-乳酸和氧生成丙酮酸和过氧化氢。通过单因素考察确定了乳酸氧化酶最适pH和反应温度为9.0和50℃C。(2)全细胞催化DL-乳酸的活性是粗酶液的1.93倍,但随催化时间延长,粗酶反应体系中丙酮酸积累量比全细胞催化体系高。这可能是因为全细胞中存在丙酮酸多条代谢通路,难以实现丙酮酸大量积累。(3)额外添加还原剂(Na2SO3、Na2S2O3、Vc)或过氧化氢酶粗酶液能抑制反应产物过氧化氢对丙酮酸的分解作用。Na2SO3抑制了乳酸氧化酶的活性,Vc和Na2S2O3在2-7 h内对丙酮酸的积累起到促进作用,但在8h时丙酮酸的积累量急剧下降。而添加过氧化氢酶粗酶液能大幅度提高丙酮酸的积累量,且在8h内一直处于上升趋势。2、为了解决反应产物过氧化氢对丙酮酸的分解,作者将乳酸氧化酶和过氧化氢酶基因共表达,构建了基因工程菌DM-2416 [pETDuet-lod-cat/ BL21(DE3)],一菌双酶全细胞催化DL-乳酸制备丙酮酸。结果表明：(1)利用pET-Duet 1载体在E.coli BL21(DE3)中成功共表达了乳酸氧化酶(LOD)和过氧化氢酶(CAT),通过Gelpro32软件灰度分析可知,约75%的LOD和65%的CAT为可溶性蛋白。(2)正交试验确定DM-2416最佳发酵条件为：装液量20 mL/250 mL锥形瓶,pH 8.5,28℃,220rpm。(3)单因素考察确定了DM-2416催化乳酸制备丙酮酸的最佳工艺条件为：pH 8.5,反应温度50℃,菌体浓度0.1 g/mL,反应容器250 mL锥形瓶,反应液中含有1 mM EDTA。乳酸最高转化率为74.4%。一菌双酶反应体系不仅解决了过氧化氢分解丙酮酸问题,而且其生成的氧可以促进乳酸氧化酶向生成丙酮酸的方向进行。3、将DM-2416与酪氨酸酚裂解酶偶联以乳酸、苯酚、氨为底物合成L-酪氨酸,为酶法合成L-酪氨酸提供了廉价来源的丙酮酸。最佳反应条件为：50℃,pH 8.5,双酶配比LOD:TPL=5:1(细胞质量比),乳酸钠：苯酚=1：1.2。当底物配比为乳酸钠浓度为10 g/L,每3h补加0.2 g,共补加6次苯酚时,L-酪氨酸的产率达到72.95%。4、氨基酰化酶是一种锌离子金属酶,广泛地用于以N-乙酰-DL-氨基酸为底物光学拆分获得L-氨基酸或D-氨基酸。利用计算机模拟和分子手段改造了氨基酰化酶(bACY1),将bACY1N-端的53个氨基酸去除,保留活性中心和底物结合位点(将此基因片段命名为xinew)。并对两种酶的酶学性质,底物特异性和Kcat/Km进行比较。研究结果显示,与bACY1相比XINEW在拆分R基较大的N-乙酰-L-氨基酸时,拆分效率较高；而在拆分R基较小的N-乙酰-L-氨基酸时,拆分效率较低。Autodock结果进一步验证了底物结合口袋的大小是决定ACY1酶活的关键因素之一。