【摘 要】
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背景:疟疾作为三大全球性公共卫生问题之一,严重危害了人类的健康,主要通过雌性按蚊叮咬后传播,其中以恶性疟原虫引起的恶性疟最为致命。2020年,全球新增疟疾病例约2.28亿,死亡病例约60.2万人。虽然我国已消除疟疾,但输入性疟疾病例依然存在,严重威胁着我国消除疟疾后的成果巩固。在疫苗未面市前,药物依然是疟疾防治主要手段。近年来,恶性疟原虫耐药的问题日益严重,给全球疟疾消除计划带来了重重阻碍。因此,
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背景:疟疾作为三大全球性公共卫生问题之一,严重危害了人类的健康,主要通过雌性按蚊叮咬后传播,其中以恶性疟原虫引起的恶性疟最为致命。2020年,全球新增疟疾病例约2.28亿,死亡病例约60.2万人。虽然我国已消除疟疾,但输入性疟疾病例依然存在,严重威胁着我国消除疟疾后的成果巩固。在疫苗未面市前,药物依然是疟疾防治主要手段。近年来,恶性疟原虫耐药的问题日益严重,给全球疟疾消除计划带来了重重阻碍。因此,对抗疟药耐药性进行快速、准确的监测显得至关重要。目的:本课题拟对湖北省武汉市输入性疟疾耐药特征进行分析,随后,基于POCT策略建立两种快速检测耐药基因的体系,为疟疾防治提供一种切实可行的解决方案。方法:从2017年至2019年,收集湖北省武汉市非洲输入性恶性疟患者的干血斑样本中提取DNA,经巢式PCR扩增pfcrt、pfmdr1和pfk13基因中的多态性片段并进行测序分析。构建pfcrt和pfmdr1基因高频位点野生型和突变型的重组质粒;针对pfcrt和pfmdr1基因设计不同的野生型以及突变型特异性引物,并进行筛选;优化等位基因特异性PCR(Allele specific PCR,AS-PCR)反应体系及反应条件;建立AS-PCR联合胶体金侧流层析检测(Lateral flow assay,LFA)系统并通过临床样本进行评价。在此基础上,针对pfcrt基因设计重组酶聚合酶扩增(Recombinase aided amplification,RAA)引物并进行筛选;设计并筛选CRISPR-Cas12a特异性crRNA,对PfCRT进行基因分型,建立RAA联合CRISPR-Cas12a检测系统。结果:1:Pf CRT 76T和356T、Pf MDR1 86Y和184F的突变率分别为9.62%、6.41%、4.72%和47.17%。在Pf CRT中检测到3种单倍型,即CVMNK(野生型)、CVIET(突变型)、CV M/I N/E K/T(混合型),分别占87.50%、9.62%和2.88%。在Pf MDR1中,NY(野生型)、NF和YF(突变型)、N Y/F、Y Y/F和N/Y Y/F(混合型)分别占单倍型的34.91%、43.40%、3.77%、15.09%、0.94%和1.89%。对于pfk13基因本次调查中未发现突变情况。在此基础上,Pf CRT和Pf MDR1共检出6种组合单倍型,其中NY-CVMNK和NF-CVMNK为主,分别占40.96%和43.37%。2.成功构建了pfcrt基因和pfmdr1基因的重组质粒并筛选出AS-PCR等位基因特异性引物;使用优化后AS-PCR/LFA的检测方法对Pf CRT的野生型CVMNK和突变型CVIET进行基因分型,使用临床样本进行验证,结果显示与测序结果保持一致,敏感度和特异性分别为95.83%(115/120)和100%(120/120)。以质粒DNA和临床样本为模板的最低检测限分别为1.5 pg/μl和100个疟原虫/μl;针对pfmdr1基因与测序结果相比较,A256T和A551T的敏感度分别为98.92%(274/277)和100%(277/277),特异性均为100%(277/277)。质粒DNA为模板的检测限分别为1.5 pg/μl和150 fg/μl,以临床样本为模板的检测限均为50个疟原虫/μl。3.成功筛选出pfcrt基因的RAA引物,在Cas12a检测中,设计野生型和突变型cr RNA,能够有效区分野生型和突变型等位基因。结论:1.研究发现pfcrt基因对氯喹、阿莫地喹和甲氟喹在内的抗疟物的敏感性正在恢复,而与哌喹耐药性相关的突变位点频率仍然处于相对较低水平。Pf MDR1的N86和184F升高提示存在蒿甲醚-芴醇耐药的风险。虽然pfk13没有检测到突变,但有必要持续监测,防止青蒿素耐药性的发生和扩散。2.建立及优化了AS-PCR/LFA检测系统以及RAA联合Cas12检测系统的两种快速基因分型技术,不仅为疟原虫耐药基因检测提供了多种有效检测方法,同时也可应用于其他感染性疾病的耐药监测和遗传性疾病诊断。
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