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苏云金芽胞杆菌(Bt)是应用范围最广的杀虫微生物,其杀虫活性主要来源于芽胞形成过程中产生的晶体蛋白,研究杀虫晶体蛋白的分子结构与功能的关系越来越受到重视。运用定点突变技术和结合生物信息学技术研究,将有助于明确和阐释伴胞晶体蛋白的结构和功能的关系。本文运用生物信息学技术,证实β20-β21 loop为Cry1Ac5蛋白结构域III中独特的功能环,通过定点突变技术研究了β20-β21 loop的结构和功能间的相互关系,获得了毒力或稳定性提高的突变子,研究内容如下:比较了Cry1A蛋白的各级结构并进一步分析Cry1蛋白结构域III的进化树,确定Cry1Ac5蛋白的结构域III作为研究对象。分析Cry1Ac5结构域III及其β20-β21 loop的特点,发现在H518FPST522、N543WGNSSI549、F578TSSLGN584等区域不同于其它Cry1A蛋白,Cry1Ac5的β20-β21 loop含有高度保守苯丙氨酸、丝氨酸及甘氨酸残基的F578、S581、G583,由此推测F578、S581、G583这三个位点极有可能是关键位点,Cry1Ac5蛋白β20-β21 Loop结构稳定性以及蛋白构象的改变可能此有关,确定以β20-β21 loop为关键,通过定点突变研究其结构与功能的关系。运用定点突变技术对Cry1Ac5的蛋白结构β20-β21 loop上10个残基进行丙氨酸扫描突变,所有突变子包括(N576A、F578A、T579A、S580A、S581A、L582A、G583A、N584A、I585A、V586A)都能表达130 kDa蛋白和产生菱形晶体,室内生测表明,突变子I585A和S581A对棉铃虫的毒力分别提高了1.86倍和1.45倍,而突变子G583A对棉铃虫的毒力则下降明显,其余突变子的毒性也有所下降。对Cry1Ac5蛋白分子的三维结构分析发现,野生型Cry1Ac蛋白的579、580、582、585位置氨基酸的侧链的侧链向外伸向Cry1Ac5蛋白分子的表面,Cry1Ac5蛋白和其受体的相互作用很可能与T579A、S580A、L582A、I585A的功能有关,而其余位置的侧链向内伸向蛋白分子内侧,可能与维持蛋白的结构稳定性有关。对I585进一步突变,构建、表达了I585E、I585F、I585T、I585V突变子,并对其进行了毒力测定:I585F、I585E、I585T的毒力下降明显,而I585V的毒力只略有下降;对I585突变子进行了蛋白酶稳定性和存贮稳定性研究,结果发现I585E、I585T、I585F的蛋白酶及存贮稳定性降低,而I585A的蛋白酶及存贮稳定性均明显提高;I585位的侧链对Cry1Ac5蛋白稳定产生了不利影响,对比野生型Cry1Ac5、I585A的晶体形态及杀虫活性,发现I585A杀虫活性高出野生Cry1Ac1.7倍以上。本研究第一次发现了Cry1Ac5此蛋白其结构域III上的β20-β21loop结构的独特之处,并且,首次报道Cry1Ac5蛋白结构域III中的β20-β21loop结构在Cry1Ac5蛋白功能中发挥的作用,此外,从生物学结构上解释了Cry1Ac5蛋白结构域III是如何与其受体分子进行识别和结合、如何维持蛋白的结构稳定性。