鸡白痢沙门菌(S.Pullorum)是一种宿主特异性致病菌,易引发雏鸡的全身性感染,导致极高的致病率和死亡率。成年鸡感染后会发展成长期带菌状态,伴随着体重减轻、产蛋减少、腹泻、生殖道损伤和异常等症状,给养禽业带来了巨大的经济损失。研究显示Ⅵ型分泌系统T6SS在沙门菌抑制共生菌生长过程中发挥重要作用,有助于细菌对宿主的入侵和在体内的定殖。但是鸡白痢沙门菌SPI-19编码的T6SS功能尚不清楚,其致病机制仍有待发掘。本研究主要对鸡白痢沙门菌SPI-19的基因组成、功能和致病机制进行了初步探索。通过λ-Red同源重组成功构建了鸡白痢沙门菌SPI-19基因簇缺失株,体内外感染实验证实SPI-19参与了细菌对宿主细胞的入侵和体内定殖,但不产生细胞毒性和抑菌能力。此外,通过检测细菌感染宿主过程中细胞因子的转录水平及ROS/RNS的释放情况,发现SPI-19参与细菌介导的免疫逃逸反应。SPI-19缺失株的转录组谱分析显示T6SS的缺失导致T3SS下调表达显著且集中在T3SS1相关基因的表达水平明显下降,qRT-PCR进一步证实T6SS的缺失导致T3SS基因的下调表达。1鸡白痢沙门菌SPI-19的序列分析和表型研究本研究首先利用生物信息学分析比对鸡白痢沙门菌SPI-19(～43kb)、肠炎沙门菌SPI-19(～12kb)和禽致病性大肠杆菌T6SS2(～23kb)的同源性。结果显示与鸡白痢沙门菌SPI-19相比,肠炎沙门菌SPI-19缺失大量核心基因;而禽致病性大肠杆菌T6SS2与鸡白痢沙门菌SPI-19核心区域同源性较高,推测SPI-19编码的Ⅵ型分泌系统可能与鸡白痢沙门菌的宿主限制性存在联系。本研究利用λ-Red同源重组技术成功构建了鸡白痢沙门菌SPI-19缺失株C79-13ΔSPI-19。生长曲线测定及生理生化鉴定结果显示,野生株和缺失株的生长速率没有差异,缺失株对细菌甘露糖代谢有影响。对禽巨噬细胞和上皮细胞的感染实验结果显示,SPI-19缺失后细菌侵入细胞的能力显著降低,并且缺失株的后续定殖能力也显著下降。利用动物实验测定野生株C79-13和缺失株C79-13ΔSPI-19对雏鸡体内脏器载菌量动态变化。结果显示,在肝脏和脾脏中,第1、3天时,野生株感染组菌量显著高于缺失株组,并且在感染后21天时缺失株率先从肝、脾中清除。在盲肠中,感染后28天野生株组菌量显著高于缺失株,并且此时回肠中也有显著性差异,表明SPI-19的缺失显著降低鸡白痢沙门菌的体内定殖能力。然而,与鼠伤寒沙门菌中SPI-6编码的T6SS功能不同的是,在体外培养状态下,野生株和缺失株均不具备杀菌能力。通过检测细菌感染巨噬细胞后乳酸脱氢酶的释放量,显示野生株和缺失株对巨噬细胞的毒性也没有差异,表明鸡白痢沙门菌SPI-19编码的T6SS不具备产生细胞毒性和杀菌的能力。2鸡白痢沙门菌SPI-19致病机制的初步探索通过qRT-PCR比较分析T6SS在体外培养和感染过程中的表达水平,结果显示T6SS在细胞感染水平时的表达量显著高于体外单独培养,证实T6SS在鸡白痢沙门菌感染细胞和体内定殖过程中发挥作用。在细胞感染水平检测鸡白痢沙门菌感染2h后巨噬细胞释放的ROS/RNS,发现SPI-19的缺失导致细胞内释放的ROS/RNS增加,表明SPI-19通过抑制宿主细胞产生活性氧、活性氮,帮助细菌逃避宿主免疫系统的攻击,实现其在细胞内的定殖。此外,我们利用转录组测序检测T6SS缺失后引起的蛋白表达差异,结果显示缺失株中T3SS调控基因和效应蛋白编码基因的表达受抑制,且T3SS1的表达量降低明显,表明T3SS与T6SS分泌系统之间可能存在联系。qRT-PCR结果进一步证实了鸡白痢沙门菌中T6SS的缺失下调了 T3SS基因的表达。鸡白痢沙门菌主要引起Th2倾向性免疫应答,通过抑制Th1免疫应答,有利于其在宿主体内的长期感染。本研究基于鸡白痢沙门菌野生株C79-13和缺失株C79-13ΔSPI-19的巨噬细胞感染实验,利用探针法qRT-PCR检测野生株和缺失株感染后细胞因子转录表达水平,评价细菌诱导的免疫应答效应。结果显示,SPI-19缺失后细菌诱导宿主IL-18、IFN-γ与促炎性细胞因子IL-1β、IL-6、iNOS和CXCLi-2的转录水平显著升高,表明SPI-19显著抑制了细胞的Th1型免疫应答,并且显著降低了促炎性细胞因子的转录水平,有助于细菌免疫逃逸。体内感染实验结果显示SPI-19缺失株诱导脾脏细胞IFN-γ的转录水平在感染后21天时显著高于野生株感染组,并且伴随着脾脏中细菌的清除;IL-1β的转录水平在感染后第3、7、28天显著高于野生株,IL-6的转录水平在感染后期第21天时显著高于野生株组,诱导体内较强的炎症反应,促进细菌的清除。这与上述载菌量实验中缺失株在攻毒后第21天在肝脾中被清除相一致,反映了 SPI-19参与抑制宿主的Th1应答,有利于鸡白痢沙门菌在体内的长期定殖。