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研究背景鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii,A.baumannii）,属革兰阴性需氧菌,是一种常见的条件致病菌,无鞭毛,移动性差,但生命力强,在自然界广泛存在。A.baumannii感染会导致菌血症、肺炎、脑膜炎、心内膜炎以及皮肤感染等[1]。A.baumannii是院内感染的主要病原体之一[2],尤其是ICU中,A.baumannii感染率高达20%[3]。WHO已将A.baumannii列为最严重的ESKAPE（Enterococcus faecium,Staphylococcus aureus,Klebsiella pneumoniae,A.baumannii,Pseudomonas aeruginosa,and Enterobacter species）菌之一。由于抗生素的滥用,已出现“多重耐药鲍曼不动杆菌”,其可有效地逃避抗菌药物的杀伤[4],为临床治疗带来新的挑战。疫苗是预防A.baumannii感染的重要手段,目前,针对A.baumannii的疫苗研究较多,但深度不够,且尚未有开展临床试验及上市的疫苗。外膜（OM）是革兰阴性菌的典型特征,为双层膜结构,包含多种与营养吸收、信号传导、细菌黏附和逃避宿主防御作用相关的膜蛋白,这些膜蛋白具有良好的免疫原性,具有潜在疫苗和疫苗递送系统的功能[5,6]。外膜蛋白（outer membrane protein,OMP）是一类膜蛋白,主要分布在革兰氏阴性菌外膜上[11],在细菌致病性和人体代谢中起着重要作用。OMP与营养吸收和防御相关,因此,许多G-菌的OMP被作为候选疫苗进行研究[12]。外膜囊泡（outer membrane vesicles,OMV）是由细菌外膜衍生而来的球形纳米结构,研究证实OMV在微生物与宿主相互作用中发挥着重要作用[13]。OMV通过多种方式影响细菌与宿主状态,包括生物膜形成、营养吸收、调节宿主免疫、细菌通信和毒素释放等[14,15]。OMV表面包含LPS、外膜蛋白和受体等,内部含有大量的周质蛋白、酶和核酸等[15],这些物质对其致病性至关重要,OMV已被证明是运输细菌毒力因子和其他物质进入宿主的天然载体[16-19]。研究表明,OMV的外表面与细菌的外表面几乎完全相同,其可激活宿主免疫系统从而调控免疫反应[20],同时还具备固有佐剂活性[21],OMV还可作为靶向给药载体和疫苗载体使用[22],因此OMV是一种很有前途的候选疫苗和药物递送载体。本研究借鉴国际上已上市的脑膜炎奈瑟菌疫苗[9,10]制备方法,通过不同方法提取A.baumannii OMP和OMVs,制备A.baumannii疫苗,首先通过样品回收率、TEM（transmission electron microscope）、蛋白质谱分析等方法对其进行表征,再通过细胞实验对其BMDCs（小鼠骨髓来源树突状细胞）活化作用和细胞因子分泌情况进行探索,最后采用小鼠A.baumannii肺部感染模型对其保护效果进行评价和对比,初步筛选出具有潜在应用价值的A.baumannii OMP/OMV疫苗。研究目的1.研究鲍曼不动杆菌外膜蛋白（Ab-dOMP）是否具有免疫保护作用;2.研究不同方法提取的鲍曼不动杆菌OMV对鲍曼不动杆菌感染的保护作用及保护效果的差异;研究方法1.Ab-dOMP的提取和免疫保护效果评价（1）用脱氧胆酸钠（DOC）从鲍曼不动杆菌ATCC 17978提取Ab-d OMP。（2）采用Lowry法测定Ab-d OMP中蛋白浓度,利用SDS-PAGE对蛋白成分进行分析。（3）制备小鼠BMDCs,并将细胞按照1×106个/ml铺在六孔板里,加入0.2μg/ml的Ab-d OMP,设置LPS和PBS作对照,平行2孔,在37℃,5%CO2恒温孵箱中培养24 h,1800 rpm离心分别收集上清和沉淀细胞。上清用于测定细胞因子,沉淀细胞通过流式细胞术检测Ab-dOMP对BMDCs成熟的影响。（4）用Ab-dOMP对小鼠（C57BL/6）进行免疫,20μg/只,共3次,每次间隔2周。每次免疫前和末次免疫两周后收集唾液、阴道灌洗液和尾静脉血,样品于-80℃保存,最后采用ELISA法检测抗体分泌水平。（51）末次免疫两周后,用LAC-4菌株按照致死剂量2×107 CFU/只进行攻毒。观察记录小鼠7天内生存率。2.OMVs的提取和免疫保护效果评价（1）通过四种不同方法提取OMV从而得到A.baumannii的四个OMVs,分别命名为sOMV（上清提取的OMV）、SuOMV（利用蔗糖提取的OMV）、dOMV（利用DOC提取的OMV）和n OMV（物理方法诱发形成的OMV）。（2）采用Lowry法测定OMVs蛋白浓度,SDS-PAGE和TEM对其蛋白成分和形态进行表征。（3）分离培养BMDCs,并将细胞按照1×106个/ml铺在六孔板里,加入0.2μg/ml的OMVs,设置LPS和PBS作对照,平行2孔,在37℃,5%CO2恒温孵箱中培养24h,1800 rpm离心分别收集上清和沉淀细胞。上清用于测定细胞因子,细胞沉淀通过流式细胞术检测OMVs对BMDCs成熟的影响。（4）用OMVs对小鼠（C57BL/6）进行免疫,20μg/只,共3次,每次间隔2周。每次免疫前和末次免疫两周后收集唾液、阴道灌洗液和尾静脉血,样品于-80℃保存,最后用ELISA法检测抗体分泌水平。（5）末次免疫两周后,用LAC-4菌株按照致死剂量2×107 CFU/只进行攻毒。观察记录小鼠7天内的生存率。3.数据分析所有数据均使用Graph Pad Prism7进行分析,所有数据采用:平均值±SD表示,作图使用Photoshop CC 2015和Adobe Illustrator CC 2015软件进行,P<0.05为差异有统计学意义（*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,***P<0.0001）。研究结果1.鲍曼不动杆菌外膜蛋白（Ab-dOMP）的提取及免疫保护效果评价:（1）SDS-PAGE结果:Ab-d OMP包含复杂的蛋白组分;（2）流式细胞术结果显示:与PBS组相比,Ab-d OMP可显著促进BMDCs的表面标志物CD40、CD80和CD86的表达上调,差异有统计学意义（P<0.05）;（3）ELISA检测细胞因子（IL-6、IL-10、TNF-α、IL-12p70）的结果:与对照组相比,用Ab-d OMP处理过的BMDCs其TNF-α、IL-12p70,IL-10、IL-6分泌量显著升高,差异有统计学意义（P<0.05）;（4）动物免疫攻毒实验显示:Ab-dOMP滴鼻免疫组生存率为71.43%,肌注组为28.57%,对照组为16.67%。Ab-dOMP免疫后可刺激产生较高水平的血清IgG和粘膜sIgA。2.鲍曼不动杆菌外膜囊泡（OMV）的表征及免疫保护效果评价:（1）OMVs为双层膜球形囊状结构,大小不均,粒径范围介于30～300 nm之间,Su OMV、Somv和n OMV形状相似,而d OMV相比之下个体较小且双层膜结构不明显。（2）质谱分析结果:SuOMV、s OMV、n OMV和dOMV所含蛋白分子数量较多分别为:454、246、397、225。SuOMV、sOMV和n OMV含量最多的为外膜蛋白,而d OMV中含量最多的为内膜蛋白。（3）流式细胞术结果显示,除dOMV外,其余三种OMVs均可显著促进BMDCs的表面标志物CD40、CD80和CD86的表达上调,差异有统计学意义（P<0.05）。（1）ELISA检测细胞因子（IL-6、IL-10、TNF-α、IL-12p70）的结果:与对照组相比,除d OMV外,其余三种OMVs处理过的BMDCs,其TNF-α、IL-12p70,IL-10、IL-6分泌量显著升高,差异有统计学意义（P<0.05）。（4）动物免疫攻毒实验显示:除dOMV外,OMVs免疫后可显著刺激产生高水平的血清IgG和粘膜s Ig A。四种不同方法提取的OMV免疫小鼠得到了不同的结果,Su OMV、sOMV和nOMV肌注免疫保护率分别为57.14%、50%和12.5%;需要指出的是,滴鼻免疫可以得到更好的保护效果,其中SuOMV可达100%,s OMV和n OMV次之,dOMV最差,为42.87%。3.研究结论和意义（1）Ab-dOMP滴鼻免疫具有良好的免疫原性,能够激活固有免疫和适应性免疫,提高鲍曼不动杆菌感染小鼠的存活率,是抵抗Ab感染的一种潜在候选疫苗。（2）采用不同方法提取的OMVs具有不同的免疫保护效果,且免疫途径对其保护效果也具有显著影响。Su OMV和s OMV可作为抵抗鲍曼不动杆菌感染的潜在候选疫苗。