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研究背景及目的特应性皮炎（atopic dermatitis,AD）是一种慢性、复发性、炎症性皮肤病,其临床表现多样,以反复出现湿疹皮损为特征,患者常伴有剧烈瘙痒。近年来,AD在中国的发病率逐年上升。目前认为,AD的发病与皮肤屏障功能障碍、免疫失调、皮肤菌群紊乱、遗传背景以及环境因素等有关。单细胞转录组测序（single-cell RNA-sequencing,sc RNA-seq）是指基于二代测序（next-generation sequencing,NGS）平台在单个细胞水平对全转录组进行扩增与测序的一项技术,能够在单细胞水平直接分析基因表达、观察细胞间异质性,能更好地理解细胞分化轨迹和基因调控关系。目前sc RNA-seq技术已经开始应用于炎症性皮肤病的研究。环境过敏原尤其是尘螨致敏与AD的发生和加重密切相关。特异性免疫治疗（specific immunotherapy,SIT）是指患者反复接触特定过敏原（提取物或重组抗原）,并逐渐增加剂量,从而对特定过敏原的耐受性增加,使过敏症状得到控制或减轻。皮下特异性免疫治疗（subcutaneous immunotherapy,SCIT）是SIT的其中一种给药方式。为探讨AD发病机制和评价SCIT的长期疗效,本课题首先结合单细胞转录组测序及多重免疫组化技术,构建成人AD患者慢性期皮损及健康对照人群皮肤组织细胞图谱,探究AD疾病状态下各细胞亚群变化,寻找差异基因,筛选特应性皮炎精准治疗潜在靶点,从转录组层面探索中国人群AD的发病机制及进展模式。其次,回顾分析了378名尘螨致敏的AD患者,通过对比接受SCIT治疗（SCIT组）和未接受SCIT治疗（Non-SCIT组）的患者在疗效、远期收益及安全性等方面的异同,探讨尘螨SCIT治疗特应性皮炎的临床价值。研究方法1、在单细胞转录组测序研究中,我们入组成人慢性期AD患者（5例）,完善血常规、血清总Ig E、特应性皮炎评分（scoring of atopic dermatitis,SCORAD）收集,取躯干四肢部位慢性期皮损区全层皮肤组织;对照组（4例）取健康人群整形手术中修剪的健康皮肤。皮肤全层组织制备单细胞悬液,利用10×Genomics平台进行sc RNA-seq。描绘皮肤组织细胞图谱;比较AD组与健康对照组细胞组成及基因表达差异,寻找疾病特异性细胞亚群和关键基因;解析角质形成细胞在AD和健康对照组中分化过程异同;探索细胞亚群间互作关系;运用多重免疫组化技术在皮肤组织石蜡切片中验证并定位细胞亚群。2、纳入2011年1月-2018年6月于皮肤科过敏中心接受规律SCIT治疗联合传统药物治疗的164例AD患者,收集患者临床评分、实验室检验结果以及SCIT治疗不良反应。纳入同期就诊的214名仅接受其他传统治疗的AD患者为对照组,收集患者临床评分及部分实验室检验结果。分析尘螨SCIT治疗特应性皮炎的疗效、远期收益及安全性。研究结果1、单细胞转录组测序共纳入87853个细胞,所有细胞聚类为9群10种细胞:基底角质形成细胞（keratinocyte,KC）,基底上KC,增殖KC,终末分化KC,T细胞,髓系细胞,黑素细胞,血管内皮细胞,成纤维细胞和血管平滑肌细胞聚为一群。2、AD中角质形成细胞高表达增殖分化基因（KRT6A、KRT6B、KRT16）和促炎基因（IFI27、IFITM1、S100s、CCL2,、SERPINB4、IGFL1、IL36）;同时角化包膜（cornified envelope,CE）、表皮分化复合物（epidermal differentiation complex,EDC）相关基因（FLG、LOR、CLDN1、OCLN）显著下调。健康皮肤中角质形成细胞沿两条轨迹分化,AD疾病状态下,角质形成细胞分化轨迹异常。3、IL19+IGFL1+KC在AD中显著增多,差异基因分析提示高表达IL19、IGFL1、S100A12、DEFB4A、PI3、CD47、KLK7、KRT6A、KRT16、NTRK1、EPGN、HRH1、HRH2等基因。皮肤组织多重免疫组化染色在皮肤原位证实IL19+IGFL1+KC在AD慢性期皮损中显著增多。4、AD慢性期皮损中T细胞高表达炎症因子IFNG（Th1）、IL13（Th2）、IL26（Th17）和IL22（Th22）,角质形成细胞分泌因子相关受体IL17RB、IL20RB、IGFLR1也显著上调。髓系细胞中,炎症性树突状表皮细胞（inflammatory dendritic epidermal cell,IDEC）及LAMP3+CCR7+树突状细胞（dendritic epidermal cell,DC）在AD慢性期皮损中特异性增多。5、细胞间通讯提示AD中细胞间通信网络更加密集,角质形成细胞、T细胞和髓系细胞之间的相互作用最为丰富,IFNG、IL13、IL26、IL22、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）、CD47和胰岛素生长因子样家族成员1（insulin growth factor-like family member 1,IGFL1）配体受体互作在AD慢性期皮损中显著上调。6、SCIT治疗后SCORAD评分和瘙痒VAS评分明显降低。SCIT组的SCORAD评分和瘙痒VAS评分改善率高于Non-SCIT组。Non-SCIT组出现新过敏原致敏的风险高于SCIT组（相对危险度RR=1.92;[95%置信区间{CI},1.30-2.85];P＜0.05）。SCIT组中,完全缓解患者治疗前后嗜酸性粒细胞计数有显著差异（P＜0.05）,非完全缓解患者治疗前后无显著差异（P=0.098）,血清总Ig E在完全缓解患者及非完全缓解患者治疗前后均无显著变化（P=0.179,P=0.979）。在SCIT治疗期间,共注射8421针次,出现不良反应231针次（2.74%）。研究结论1、AD角质形成细胞异常增殖分化,导致表皮肥厚、皮肤屏障功能障碍、血管增生及炎症浸润进展,可能在AD发生发展中起重要作用。2、IL19+IGFL1+KC在AD皮损中显著增多,可能参与皮肤屏障破坏、联系并放大Th2、Th17炎症反应,同时介导皮肤瘙痒。3、AD慢性期皮损中Th1、Th2、Th17、Th22炎症激活,呈现出以2型炎症反应为主的多免疫轴活化。4、规律SCIT治疗可减轻尘螨致敏的中重度AD患者的疾病严重程度和瘙痒症状,且治疗总体安全。多种过敏原致敏患者也可以从尘螨SCIT治疗中受益。SCIT治疗可获得远期收益,能够改善特应性体质和阻断特应性进程。