蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)是革兰氏阳性菌,土壤微生物,在自然界中广泛存在。蜡样芽胞杆菌产生芽胞的特性使其具有抵抗高温,干燥等环境压力的能力。当侵入哺乳动物组织时,蜡样芽胞杆菌也被认为是机会致病菌,可以引起局部或系统的感染。因此研究蜡样芽胞杆菌毒力相关的基因及与宿主相互作用的机制成为热点。最新的研究应用体内表达技术(IVET)鉴定了B. cereus ATCC 14579菌株侵染大蜡螟(Galleria mellonella)过程中特异表达的启动子,其中的B1启动子在昆虫中肠的早期表达。B1启动子位于spsA基因的上游,其上游是一个编码双组分系统(two-component system)的spsR和spsK基因。spsA基因的下游是spsB基因和spsC基因。Sps系统中的spsRK和spsABC形成两个转录单元。spsABC操纵子的启动子B1在体外受6-磷酸葡萄糖(G6P)或6-磷酸果糖(F6P)的诱导。因此定义这个系统为磷酸糖信号传导系统(Sugar Phosphate Sensor System)。在这个基础上,本论文对Sps系统各组分的功能进行了一系列的研究,主要内容包括:对B. cereus ATCC 14579菌株Sps系统中各基因进行生物信息学分析,结果表明,spsA基因编码一个未知功能的假设蛋白(Hypothetical protein),其N-端有一段22个氨基酸编码的信号肽序列。spsB基因编码ABC转运系统底物结合蛋白(ABC transporter substrate-binding protein ),其N-端有一段18个氨基酸编码的信号肽序列。spsC基因编码磷酸甘油酸盐转运蛋白(Phosphoglycerate transporter),其蛋白结构属于主要促进蛋白家族(Major facilitator superfamily),氨基酸结构中有12个跨膜结构域,其DNA序列与E. coli中编码3-磷酸甘油转运蛋白(Glycerol-3-phosphate transporter)的glpT基因的相似性为43%;与编码6-磷酸葡萄糖运输蛋白(Glucose-6-phosphate)的uhpT基因的相似性为31%。spsRK组成双组分系统(two-component system),其氨基酸序列中具有典型的组氨酸激酶和反应调节蛋白结构域。Sps系统在B. cereus族和致病菌梭状芽胞杆菌中十分保守。应用同源重组的方法,构建了Sps系统中5个基因的单突变体,双突变体及多突变体,并构建了相应的互补菌株和过表达菌株。并在这些菌株中分析了spsABC的启动子B1的体内及体外活性。β-半乳糖苷酶体外活性分析表明,B1启动子在spsA,spsB,spsRK,spsAC和spsBC突变体中无诱导活性,说明spsA,spsB和spsRK基因对于信号传导系统是必要的;而在spsC突变体中,有很强的诱导活性,G6P的吸收率实验表明,SpsC具有吸收外源G6P的功能。gfp转录融合分析表明,Sps系统在宿主体内被诱导表达,体内B1启动子在不同突变体的诱导活性与体外的情况一致,尽管体外的诱导环境相对简单,但我们还是模拟出了和体内相似的环境,说明我们在体外找到了与体内一样的诱导物。应用配体结合和戊二醛交联的方法,研究了SpsA蛋白和SpsB蛋白的体外结合互作,结果表明,在G6P存在和缺失的情况下,纯化的SpsA蛋白可以与SpsB蛋白结合。Western杂交显示SpsA蛋白定位于膜表面。对Sps系统进行了进一步的转录调控分析,在B1启动子序列中,推测出SpsR,CcpA和CodY的结合位点,这些位点的缺失导致整个启动子活性的丧失或减弱。并且在spsRK突变体中,B1启动子无诱导活性,说明B1启动子受SpsRK的正调控;而在ccpA突变体中的活性分析表明,B1启动子在对数生长期受CcpA的正调控,在稳定生长期受CcpA的负调控,spsRK的启动子在对数生长期受CcpA的负调控。说明CcpA对Sps系统的调控存在多种不同的机制。通过对B1启动子不同长度片段的活性分析表明,在B1启动子序列中,可能还存在其它的调控因子结合位点。B. cereus中的磷酸糖信号传导与运输途径涉及了5个基因的功能,表现出一种新的调控机制,对于芽孢杆菌族和梭状芽胞杆菌的宿主适应性具有重要的意义。我们的研究为双组分系统在宿主与致病菌互作中的功能,尤其是在肠道中的互作机制,提供了新的研究视角。