论文部分内容阅读
背景:肾癌是常见的泌尿系统恶性肿瘤,中位无进展生存期较低。舒尼替尼是治疗晚期肾癌最有效的药物之一,虽然舒尼替尼治疗肾癌已经被视为常规方案,但是由于副作用和耐药的出现,总体上仍然未能明显提高患者生存率。因此,寻找新的、更有效的治疗肾癌的方法意义重大。目的:在本研究中,以肾癌786-O细胞为研究对象,首先利用慢病毒介导miR-143过表达后检测细胞迁移、增殖和侵袭能力的改变,接着检测舒尼替尼处理细胞后miR-143表达变化,进而探讨舒尼替尼调控miR-143对肾癌细胞迁移、增殖和侵袭的影响及可能的机制。方法:将miR-143mimics、miR-NC慢病毒原液分别稀释10倍、100倍、1000倍、10000倍后侵染293T细胞,72h后荧光显微镜下计数荧光细胞,结合病毒稀释倍数计算病毒滴度;将miR-143mimics、miR-NC慢病毒稳转入肾癌786-O细胞,qRT-PCR检测miR-143相对表达量;用浓度为0、2、4、6、8、10、12μmol/L的舒尼替尼处理786-O细胞48h,计算舒尼替尼作用于786-O细胞48h的IC50值,选取该值作为后续实验加药浓度;用IC50值浓度的舒尼替尼处理786-O细胞48h后提取RNA,qRT-PCR检测miR-143表达变化;786-O细胞稳转miR-143mimics后,采用创伤愈合实验、噻唑蓝比色法、Transwell实验分别检测细胞迁移、增殖和侵袭能力的变化,采用实时荧光定量PCR技术、免疫印迹技术检测细胞DNMT3B RNA和DNMT3B蛋白、p-Akt蛋白表达情况;用IC50值浓度的舒尼替尼处理786-O细胞6,12,24h后,采用创伤愈合实验检测细胞迁移能力变化;用IC50值浓度的舒尼替尼处理786-O细胞48h后,采用噻唑蓝比色法、Transwell实验检测细胞增殖和侵袭能力的变化,实时荧光定量PCR技术、免疫印迹技术检测细胞DNMT3B RNA和DNMT3B蛋白、p-Akt蛋白表达情况。结果:miR-143mimics、miR-NC慢病毒滴度均大于1×10~8TU/ml,符合实验要求;成功构建miR-143mimics稳转786-O细胞株(P<0.05);舒尼替尼作用于786-O细胞48h的IC50值为6μmol/L;舒尼替尼上调了786-O细胞miR-143的表达(P<0.05);稳转miR-143mimics和用舒尼替尼处理后,786-O细胞的迁移、增殖和侵袭能力降低,DNMT3B RNA和DNMT3B蛋白、p-Akt蛋白表达下降,且二者共同作用时效果更明显(P<0.05)。结论:舒尼替尼通过上调miR-143抑制了肾癌786-O细胞的迁移、增殖及侵袭;舒尼替尼通过上调miR-143下调了786-O细胞中DNMT3B、p-Akt蛋白表达发挥抗肿瘤作用。