本论文主要分两个章节,第一章节重点研究了锌指蛋白BCL11A负调控Y-珠蛋白表达的分子机制;第二章节主要研究了人源BAF180蛋白质第一个BAH结构域的晶体结构以及其与核小体的相互作用。第一章节:血红蛋白的主要作用是将氧气运输到身体的各个组织和器官,来维持人类正常的生命活动。血红蛋白由两条α类型和两条β类型的亚基组成,其编码基因分别位于人类第16号和11号染色体上。β类型的亚基由5个不同的珠蛋白基因(ε-,Gγ-,Aγ-,δ-,和β-珠蛋白)编码,并且在胚胎发育过程中会经过两次发育转换。在胚胎期,主要表达ε-珠蛋白;胎儿期,主要表达γ-珠蛋白;成人期,主要表达β-珠蛋白和δ-珠蛋白。此时,胎儿血红蛋白(HbF或者α2 γ2)的水平降到1%以下。β-血红蛋白疾病是由于编码β-珠蛋白的基因发生突变导致β-珠蛋白的结构发生异常或合成异常,包括镰刀型贫血症和β-地中海贫血症。目前,β-血红蛋白疾病治疗方案有羟基脲(hydroxyurea)治疗、输血治疗、骨髓移植和基因治疗。患有“遗传性胎儿血红蛋白持续存在症(HPFH综合症)”的病人没有完成正常的珠蛋白转换,因此血液中仍然含有一定比例的胎儿血红蛋白。对于正常人来说,这种HPFH综合症对他们的健康状况没有显著影响,但是对于患有β-血红蛋白疾病的患者,却能够极大地缓解他们的症状。因此重激活Y-珠蛋白的表达可以作为一种治疗β-血红蛋白疾病的策略。全基因组关联分析研究(GWAS)发现转录因子BCL11A在调控γ-珠蛋白表达上起着重要的作用。在人类造血干/祖细胞CD34+细胞中敲除BCL11A,γ-珠蛋白表达明显上升;在患有镰刀型贫血症的小鼠中,通过条件型敲除BCL11A的表达,可以提高小鼠体内Y-珠蛋白的产量,也可以修正小鼠的表型。尽管大量的功能实验已经证实BCL11A可以调控γ-珠蛋白的表达,但是具体的分子机制仍然还不清楚。直到最近,两个课题组同时报道BCL11A通过其C端的三个串联的C2H2锌指结合γ-珠蛋白基因启动子上游的115bp区域。巧合的是,天然突变G-117A以及C-1 14A/T/G位于该区域内并且被鉴定存在于患有HPFH综合症的病人体内,但是这些天然突变对于负调控γ-珠蛋白的表达机制也还不清楚。我们通过体外克隆表达以及纯化获得了 BCL11A的C端三个串联的锌指Znf4-6,并设计不同长度的DNA序列用于后续的结晶实验,最终获得了 2.50 A的BCL11A和12bp的DNA复合物晶体结构。通过结构分析以及ITC滴定实验,我们验证了 G-117A和C-114A/T/G突变能够极大地减弱了 BCL11A和DNA的亲和力,这与晶体结构中Znf4-5与G-117以及G-114之间存在相互作用一致。我们也通过ITC实验验证了 ZBTB7A蛋白的C端四个串联的锌指可以结合在γ-珠蛋白基因启动子上游200bp区域,亲和力约为120 nM,该区域内也存在一些与HPFH综合症相关的点突变,目前正在进行后续研究。第二章节:染色质重塑作为表观遗传调控的重要组成成分,主要依赖于染色质重塑复合物来实现功能,主要包括SWI/SNF蛋白家族、ISWI蛋白家族、CHD蛋白家族和INO80蛋白家族。在人类细胞中,SWI/SNF家族又可以分为BAF和PBAF两个蛋白质亚家族。BAF180是PBAF亚家族中独有的亚基,在维持基因组稳定、促进哺乳动物心腔成熟、DNA转录过程中的损伤修复以及抑制乳腺癌、肾细胞癌等起着重要的作用。BAF180含有6个Bromo结构域、2个BAH结构域和1个HMG box结构域。其中它的6个Bromo结构域已经被解析,而C末端的HMG box结构域的功能主要是参与结合DNA,但是关于BAH结构域的结构以及功能尚未有文章报道。之前文章报道BAH结构域可以参与识别组蛋白翻译后修饰来调控基因的表达;也可以参与结合核小体来调控基因沉默;也可以参与蛋白-蛋白相互作用。因此探究BAF180的BAH结构域的结构与功能对于理解BAF180的生物学功能具有很重要的意义。我们解析了 BAF180的第一个BAH结构域的晶体结构,并通过体外组装核小体,利用GST pull-down、EMSA以及ITC实验证实了 BAH结构域可以直接结合体外组装的核小体,也能与293T细胞中提取的核小体相互作用。通过大量的点突变实验和核磁滴定实验,我们初步鉴定了 BAH结构域与核小体相互作用的界面信息。我们希望通过后续的核磁滴定实验,能够获得核小体上的作用界面信息,从而搭建结构模型,获得BAH结构域与核小体的三维结构。