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研究背景急性呼吸道感染(Acute respiratory tract infection,ARTI)是儿科临床中最为常见的疾病,也是5岁以下儿童死亡的重要原因。呼吸道感染的病原十分复杂,病毒在其中占有很大的比重,如呼吸道合胞病毒(RSV)、人偏肺病毒(hMPV)、流感病毒(A,B型)、副流感病毒(1,2,3型)和腺病毒(AdV)等。但迄今为止仍有相当部分儿童急性呼吸道感染的病原未能阐明,使针对性预防和治疗力度大大减低,且可能间接造成抗生素滥用。因此,逐步阐明儿童呼吸道感染中这部分未知病毒病原的构成、发病率及特征具有十分重要的实践意义。2005年8月22日,瑞典学者Tobias Allander采用随机PCR扩增,测序并结合生物信息学方法对儿童急性呼吸道感染样本进行大规模筛查,发现一种新的细小病毒,命名为人博卡病毒(Human Bocavirus,HBoV)。它与牛细小病毒(Bovine parvovirus,BPV)和猪细小病毒(Minute virus of Canine,MVC)同属细小病毒亚科中的博卡病毒属。此后,澳大利亚、日本、加拿大、法国、德国、韩国、美国等国家相继检测到该病毒,提示其全球流行。从目前研究资料看,HBoV感染的发病率为1.5%-18.3%,在不同年龄组人群中都可致急性呼吸道感染,但5岁以下儿童感染率较高,尤以6个月至2岁常见。有关HBoV的血清流行病学、免疫发病机制及防治手段的研究则尚未见报道。在国内,中国疾病预防控制中心对湖南郴州市儿童呼吸道博卡病毒感染进行了报道。浙江省亦在急性下呼吸道感染患儿的鼻咽吸取物中检测到HBoV,还建立了博卡病毒的荧光定量PCR检测方法。广州地区利用原核表达的HBoV VP1蛋白,进行了血清流行病学调查,阳性率为7.06%。但以上课题组的研究,多是在冬季收集标本,标本量亦较小。目的分析HBoV感染的发病、分布季节、年龄、临床表现等情况,证实其亦为重庆地区儿童急性呼吸道感染的病原之一并初步阐明其分子流行病学规律,为进一步的防治研究提供理论依据。方法1.标本收集: 2006年4月-2007年3月,在重庆医科大学附属儿童医院呼吸内科病房收集因呼吸道感染住院患儿的鼻咽吸取物标本。2.直接免疫荧光法(DFA)检测标本中的常见呼吸道病毒感染情况:标本处理后,细胞沉渣用于直接免疫荧光法检测呼吸道合胞病毒、流感病毒A、B亚型、副流感病毒1、2、3型及腺病毒。3.用PCR方法检测标本中HBoV:标本收集后,取200μl用QIAamp (?) DNA Mini Kit (QIAGEN Inc,USA)提取病毒基因组DNA,提取的DNA用于HBoV的NS1基因及NP-1基因核酸片断的扩增。4.流行病学分析:分析HBoV检出阳性率、HBoV感染的季节分布、年龄分布特点等; HBoV与其它呼吸道病毒病原协同感染情况等。5.HBoV阳性标本患儿临床资料分析:患儿的入院诊断、主要症状、实验室检查、X线表现特点等。6.序列测定及比对分析:将阳性PCR产物进行序列分析,与GeneBank中的HBoV ST1和HBoV ST2序列比对;并运用ClustalX及DNAStar软件对其遗传进化发生和核酸、氨基酸的同源性进行分析。结果1.在2006年至2007年一年期间,共收集呼吸道感染住院患儿鼻咽吸取物标本395份。2.PCR检测:395份鼻咽吸取物中共检测到21份阳性扩增产物,阳性率为5.3%(21/395)。NP-1基因产物约为354bp,NS1基因产物约为291bp。将两个基因片断均成功扩出的标本作为阳性标本。3.在21份鼻咽分泌物HBoV PCR阳性的患儿中,男性16例,女性5例;年龄分布较集中,2岁以下20例,占阳性病例总数的95.2%;小于1岁者13例,占61.9%,仅有1例患儿的年龄大于2岁。发病季节以冬季(12月、1月、2月)为主,检出9例;其次是夏季,春秋两季较少见。临床表现主要为咳嗽、吼喘、气促、紫绀以及肺部湿罗音和哮鸣音。临床诊断以下呼吸道感染为主,分别为:8例诊断为间质性肺炎,4例支气管肺炎,4例毛细支气管炎,2例支气管炎,2例迁延性肺炎、1例右肺肺炎。21名HBoV阳性患儿的病程大都偏长,12例病程超过10天,其中有5例超过1个月。21例HBoV PCR阳性患儿中13例出现吼喘,提示HBoV可能是导致儿童喘息的病原之一。3例(14.3%)伴有呼吸道合胞病毒(RSV)感染。4.PCR扩增产物序列测定和比较分析:选取10份NP-1基因PCR产物进行核苷酸序列测定,并在GeneBank中进行比对。应用ClustalX软件对序列进行遗传发生进化分析显示:10份扩增产物序列在进化上距HBoV ST1较近,而与HBoV ST2距离较远。利用DNAStar软件对21份产物及HBoV ST1、ST2的核苷酸序列进行了变异分析,比较结果显示:在核苷酸水平上,21份产物与HBoV ST1、ST2的核苷酸同源性分别为99.0%～100%、98.7%～100%,21份产物扩增片断之间的同源性为98.5%-100%,显示高度的同源性。在氨基酸水平上,21份扩增产物与HBoV ST1、ST2的同源性为99.0～100%。结论通过PCR检测,证实HBoV是重庆地区儿童呼吸道感染的病毒病原之一。HBoV感染主要以2岁以下儿童为主,季节以冬季较多见,HBoV感染的临床表现与呼吸道合胞病毒感染相似,并可能与喘息性疾病及重症呼吸道疾病有关。重庆地区儿童呼吸道博卡病毒感染以HBoV ST1为主,且序列变异度小。呼吸道合胞病毒可能与HBoV协同感染患儿。