糖尿病是一种广泛分布于全球的以高血糖为特征的复杂慢性代谢性疾病,其发病时的高血糖症状会导致患者的糖、脂代谢紊乱,从而引起一系列慢性并发症。随着人类文明的持续进步和生活水平的不断提高,糖尿病患病率逐年上升。其中2型糖尿病患者明显增多,目前约占糖尿病总患病人群的90%以上。2型糖尿病的特征主要表现为胰岛素抵抗,即由胰岛素调节的细胞糖代谢能力下降或胰岛β细胞功能受损引起的胰岛素分泌减少,或两者兼而有之。这种疾病的存在愈发威胁着人类的生命健康。目前2型糖尿病的治疗方法及药物多种多样,但寻找一种安全有效的2型糖尿病的治疗药物仍然是一个巨大的挑战。因此,寻找一种更安全、更有效的2型糖尿病治疗药物是眼下迫在眉睫的任务。2017年12月5日,美国FDA批准了由丹麦Novo Nordisk公司研发的一种新型治疗2型糖尿病新药索马鲁肽(又名:Semaglutide或Ozempic)上市。索马鲁肽是GLP-1(胰高血糖素样肽-1)受体激动剂,通过刺激胰岛素的分泌来降低患者体内的血糖水平,同时亦能降低患者的血压与体重。索马鲁肽在人体内具有长达165小时的半衰期,是目前最新研发出来的一种一周给药一次的GLP-1受体激动剂。索马鲁肽还具有极高的安全性,它引起胰腺炎或由于重复给药引起低血糖症状的风险极低。鉴于索马鲁肽的上述优势,目前索马鲁肽在欧美等国家正在成为治疗2型糖尿病的一线药物。索马鲁肽是一个含有一条长脂肪侧链的三十一肽,通过将GLP-1受体激动剂利拉鲁肽(Liraglutide)结构上的8位谷氨酸残基(Glu)替换成了 2-氨基异丁酸残基(Aib)以及将27位赖氨酸残基上的6位氨基连接的软脂酰谷氨酸替换成了由两个8-氨基-3,6-二氧杂辛酸(AEEA)、谷氨酸(Glu)和十八烷二酸偶联而成的长脂肪链而制得。作为一种多肽类药物,索马鲁肽的合成方法与其他多肽类药物类似,主要通过固相合成法制备。考虑到固相合成法存在的一些缺点以及索马鲁肽结构的特点(它含有一条长脂肪侧链,其合成原料价格昂贵),我们尝试将一种新型基于疏水载体辅助的液相肽合成法用于索马鲁肽的合成,并在此基础上进行工艺优化。这种新方法的原理类似于传统固相合成法,也是将多肽C末端的氨基酸与载体偶联,然后通过逐个偶联的方式得到所需片段,最后通过裂解得到产物。然而,该方法与固相合成法具有明显本质区别:其所使用的载体在非极性溶剂中高度易溶,而在极性溶剂中难溶;偶联和脱保护反应为均相反应,可在溶液中进行,能通过TLC法进行简单直观的监测,有效减少了杂质的产生;当反应完成后,只需向反应液中加入不良溶剂即可析出产物结晶,分离纯化步骤像固相合成法一样易于处理;由于是均相反应,其氨基酸以及催化剂的投料量更加合理,无须像固相合成法那样大幅过量,这在很大程度上降低了制备成本。基于该方法的特点和索马鲁肽结构性质,我们将索马鲁肽分为以下六个片段:Boc-His(Trt)-Aib-Glu(OtBu)-Gly-OH(片段 1)、Fmoc-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-OH(片段 2)、Fmoc-Val-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Glu(OtBu)-Gly-OH(片段 3)、Fmoc-Gln(Trt)-Ala-Ala-Lys[-AEEA-AEEA-γ-Glu(α-OtBu)-Oct(OtBu)]-Glu(OtBu)-Phe-OH(片段 4)、Fmoc-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-OH(片段 5)、Fmoc-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-OH(片段6)。我们选择2,4-二(二十二烷氧基)苯甲醇作为可溶性疏水载体,将氨基酸的羧基通过酯化反应偶联到载体的醇羟基上,并通过Fmoc保护法依次偶联氨基酸得到六个Fmoc保护的连有载体的片段:Tag-片段1-6。然后分别脱去Tag-片段1-5的载体,并在Tag-片段6的基础上依次按片段5-1的顺序(即索马鲁肽主链C末端到N末端的顺序)偶联得到Tag-全保护索马鲁肽,最终通过裂解和制备液相纯化得到索马鲁肽。在索马鲁肽的合成研究中,由于片段4结构中赖氨酸残基(Lys)的氨基上连有长脂肪侧链,我们选用Alloc-Lys(Fmoc)-OH作为片段上赖氨酸残基的原料。当偶联至此氨基酸残基时,首先脱去Fmoc保护基并使用侧链所需要的三种原料依次偶联合成侧链,然后脱去Alloc保护基并偶联主链上剩余的氨基酸残基得到片段4。这也是Alloc保护基法在此种多肽液相合成法中的首次应用。然后本文对此方法合成索马鲁肽的工艺进行了优化。我们考察了各种影响因素如催化剂、反应温度、投料比以及后处理方法等对反应的影响,建立了一条成本低、收率高、产品纯度高且操作简便的合成路线。其主要研究成果体现在以下几个方面:①在片段C末端氨基酸与载体的偶联反应中,当载体、氨基酸和DIC的投料比为1:1.2:1.5时,在40℃反应条件下,合成了四种高纯度Fmoc保护的片段:Fmoc-Gly-O-Tag、Fmoc-Phe-O-Tag、Fmoc-Asp(OtBu)-O-Tag 和 Fmoc-Leu-O-Tag,极大的降低了后续分离纯化的难度;②在片段C末端氨基酸与载体的偶联反应中,由于偶联产物颗粒细小且粘稠,导致过滤极其困难。在过滤前将硅藻土加入到不良溶剂的结晶液中充分混合后再抽滤,巧妙解决了过滤困难的技术难题。然后用产物的良溶剂(例如四氢呋喃)提取滤饼(硅藻土与产物的混合颗粒)达到了高效分离纯化的目的;③在脱除Tag-片段1载体的反应中,通过调整三氟乙酸的用量,可以减少组氨酸残基上的三苯甲基保护基的脱落,使得此步反应收率由73.28%提高到93.02%,产品纯度由81.95%提高到92.86%;④在片段4的合成中,我们使用四(三苯基膦)钯和苯硅烷催化体系将Alloc化学应用到了这种液相合成法中,这使片段4的纯度达到98%以上;⑤在脱Fmoc保护反应中,当pH调至6时,能有效克服Tag-片段6难以结晶的难题,使得此片段收率达到76.73%,纯度达到96.73%;⑥在依次偶联各片段合成Tag-全保护索马鲁肽的反应中,我们采用DMT-MM作为偶联剂,通过筛选和优化得到合理的投料比反应体系,使裂解后的索马鲁肽粗肽总收率和纯度显著提高,分别达到51.82%和62.25%。而最新的索马鲁肽固相合成专利文献报道的粗肽总收率和纯度分别为39.22%和53.51%,极大提高了索马鲁肽的合成效率。综上所述,疏水载体辅助的液相多肽合成法合成索马鲁肽相较于固相多肽合成法而言,投料比更合理、产品收率和纯度更高,这些都可以直观地体现到成本的降低上。此外,本文建立的索马鲁肽疏水载体辅助液相多肽合成法的工艺路线,操作简便、反应条件温和,具有潜在的工业应用价值。