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研究背景角膜病已成为仅次于白内障的第二大致盲原因,目前治疗角膜盲的主要手段仍然是角膜移植,但免疫排斥反应仍是导致手术失败的最主要原因。如何有效防治移植排斥反应是提高角膜移植手术成功率的关键因素之一。近年有关学者认为:造成高危角膜移植术后免疫排斥反应的一个重要原因是供体和受体MHC之间的抗原差异性和组织不相容造成的。关于HLA抗原配型在角膜移植中的应用已有大量报道,但多为回顾性研究,也存在明显争议。以往采用的HLA六抗原配型标准在临床应用受到诸多客观条件的限制,不便于术前的供体选择。Terasaki教授等提出的HLA氨基酸残基配型并应用于肾移植取得成功经验,提示角膜移植术前进行HLA配型成为可能。为此,本课题提出设想,通过HLA-Ⅰ类和HLA-Ⅱ类抗原位点检测,将HLA氨基酸残基配型应用于角膜移植的供体和受体选择,以减少供体和受体之间的MHC抗原差异,增加供体和受体之间的组织相容性,降低术后的排斥反应发生率,提高手术成功率。方法、结果和结论1.离体角膜HLA抗原表达的应用基础研究目的:检测离体角膜上皮和内皮细胞HLA-A、B、C和HLA-DR位点抗原的表达量,为角膜移植术前进行HLA组织配型提供一试验依据。方法:对40只健康成人离体眼球的角膜细胞进行体外培养,采用间接免疫萤光技术标记HLA-A、B、C和HLA-DR抗原,用ACAS-570激光扫描细胞仪分析细胞表面抗原。结果:正常角膜上皮和内皮细胞均可见HLA-A、B、C位点的表达,而无HLA-DR位点的表达。角膜上皮和内皮细胞的HLA-A、B、C位点表达的荧光强度分别为601.0±22.6和511.5±20.5(P<0.01)。结论:正常成人眼角膜上皮和内皮细胞存在有HLA-A、B、C抗原的分布和表达。2.HLA氨基酸残基配型应用于外伤或角膜溃疡的初步研究目的:将HLA氨基酸残基配型应用于严重眼外伤和感染性角膜盲患者术前的供受体选择,初步评价其在角膜移植中的作用。方法:选择4例严重眼外伤和角膜溃疡患者,术前供体和受体进行HLA-Ⅰ类和HLA-Ⅱ类抗原位点检测。HLA检测方法:单克隆抗体一步法或Micro-SSP方法,或快速免疫磁珠法提取淋巴细胞,采用HLA氨基酸残基配型策略进行HLA氨基酸残基配型,选择HLA抗原位点低错配的供体和受体。角膜移植术后常规应用抗排斥药物治疗。结果:选择低错配的供体,未出现排斥反应。结论: HLA-Ⅰ类和HLA-Ⅱ类抗原位点检测方法简便迅速、结果可靠,角膜移植术前进行HLA配型切实可行。3.HLA氨基酸残基配型应用于高危角膜移植目的:初步评价HLA氨基酸残基配型应用于高危角膜移植中的效果。方法:44例高危角膜盲患者,均为角膜新生血管丰富、角膜已结膜上皮化或药物治疗无效的感染性角膜溃疡,根据HLA位点的相配数目分为4组:HLA的2错配组、3错配组、4错配组和5错配组;又将2错配组和3错配组归入低错配组,将4错配组和5错配组归入高错配组。分析高危角膜病人与供体之间的HLA抗原位点相配情况,并比较高错配组和低错配组的排斥反应发生率。结果:术后排斥反应发生率为79.5%,在2、3、4和5错配组中分别为9.1%、11.3%、27.3%和31.8%。高错配组和低错配组的排斥反应发生率分别为59.1%和20.4%,经Fisher精确检验P=0.044,两组间有显著性差异,相对危险度RR=1.5。表明HLA高错配组的排斥反应发生率明显高于低错配组,其排斥反应的危险性是低错配组的1.5倍。低错配组的用药时间较短,出现排斥反应时,药物治疗效果较佳,而高错配组药物治疗效果欠佳,全身用药时间较长。结论:对于高危角膜患者,术前进行HLA氨基酸残基配型选择低错配的供体,可降低排斥反应发生率。4.HLA氨基酸残基配型应用于眼外伤后的角膜移植目的:比较眼外伤后的高危角膜组和低危角膜组中HLA氨基酸残基配型的作用程度,进一步评价其应用于眼外伤后的角膜移植中的效果。方法:66例(67眼)外伤性角膜盲患者,分为新生血管丰富的高危角膜组(51眼)和单纯角膜白斑的低危角膜组(16眼),同样根据HLA位点的相配数目分为4组:HLA的2错配组、3错配组、4错配组和5错配组;又将2错配组和3错配组归入低错配组,将4错配组和5错配组归入高错配组。结果:高危和低危角膜组的排斥发生率分别为76.5%和31.3 %,χ2=11.047,P=0.001,两组间有非常显著性差异。高危角膜组中,高错配和低错配组的排斥反应率分别为90.5%和63.2%,经Fisher精确检验P =0.00461,两组间有非常显著性差异,相对危险度RR=1.772。低危角膜组中,高错配和低错配组的排斥反应率分别为33.3%和25.0%,经Fisher精确检验P=1.00,无统计学差异。高危角膜组的排斥反应较重,需要全身用药,而低危角膜组排斥反应轻,局部用药易于控制。结论:眼外伤后新生血管丰富的高危角膜,术前进行HLA氨基酸残基配型选择低错配的供体可降低排斥反应发生率,而对于低危角膜患者,术前HLA配型意义不大。小结,本课题通过应用基础研究与临床应用研究紧密结合,在国内率先将HLA氨基酸残基配型应用于眼科领域,首次将HLA氨基酸残基配型应用于角膜移植术前的供受体选择。术前通过选择低错配的供受体,降低了高危角膜移植术后免疫排斥反应发生率,提高了手术成功率。特殊取材环境下灵活应用HLA抗检测方法,经济适用、简便快速,在基因水平进行HLA抗原检测,结果可靠。术前等待时间短,为术前供受体之间进行HLA氨基酸残基配型提供了重要的保证。但是,供受体的HLA抗原低错配还不能完全阻止排斥反应的发生,术后仍需配合抗排斥药物。今后还需进一步研究。