论文部分内容阅读
免疫磁珠(Immunomagnetic Beads,IMB)是表面包被有抗体(或配体)的磁性微球。能特异性吸附抗原(受体)等物质,已广泛应用于生物和医学等领域。本研究利用化学共沉淀法合成磁珠,再将抗GST标签蛋白的抗体偶联到改性后的磁珠表面,从而制得表面包被GST抗体的IMB,即IMB-GSTAb,然后用IMB-GSTAb捕获GST-HA1(禽流感病毒HA1抗原)融合蛋白,最后用捕获GST-HA1的IMB免疫实验动物鸡,探索IMB-GSTAb的生物安全性和免疫增强作用。动物实验证明IMB具有一定的免疫增强作用和良好的生物安全性。本研究为寻找一种操作简便、安全有效且价格低廉的新型免疫佐剂提供了参考,同时也为提高禽流感疫苗的免疫效价提供了新的思路。1.抗GST标签蛋白抗体的制备培养含GST表达载体(pGEX-KG)的大肠杆菌BL21,收获GST蛋白。将经Sepharose 4B柱子纯化得到的GST蛋白免疫2周龄艾维因鸡,制备鸡抗GST多克隆抗体。ELISA检测血清效价达1.28×104,Western blot结果表明制备的抗体具有生物学活性。采用饱和硫酸铵粗提和葡聚糖凝胶(Sephadex G-200)过柱相结合的方法纯化抗体,得到了纯度较高的抗体IgG,结果显示本研究制备的鸡抗GST多抗与GST-NS1融合蛋白、GST-NP融合蛋白和GST-HA1融合蛋白均具有良好的反应性。2. IMB-GSTAb的制备采用化学共沉淀法合成Fe3O4纳米粒子,并对其表面进行修饰,使其表面带有-NH2基团和-CHO基团,得到平均粒径在30-200 nm之间并具有超顺磁性的磁珠,修饰前后磁珠的浓度分别为15.62 mg/mL和5.40 mg/mL。将磁珠与GST抗体偶联制备IMB-GSTAb,用IMB-GSTAb捕获GST与禽流感病毒HA1的融合蛋白GST-HA1。通过控制和改变缓冲介质、溶液pH值、反应时间和温度等参数,优化磁珠偶联抗体的条件。用紫外分光光度计测定、SDS-PAGE分析和IMB-ELISA检测等方法对磁珠偶联抗体的效果进行评价,从而获得抗体最佳偶联条件为0.01M PB (pH7.4)缓冲液,37℃振荡孵育6h;IMB的最佳封闭条件为3%脱脂奶粉,37℃封闭1h; IMB-GSTAb捕获GST-HA1的最佳反应条件为37℃,2 h；-NH2末端IMB最大捕获量为297.2±11.7μg/mL,-CHO末端IMB最大捕获量为299.1±6.9μg/mL3.IMB佐剂效应检测用捕获GST-HA1的IMB免疫2周龄鸡(A组),同时设四个对照组,分别为IMB-GSTAb组(B)、GST-HA1抗原组(C)、禽流感灭活苗(Re-5株)组(D)和PBS组(E),每组5只,分别于免疫后7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、42 d翅下静脉采血,用血凝(HA)和血凝抑制(HI)试验测定血清抗体效价,结果显示,首免后实验组和D组抗体效价上升较快,到第3周时实验组与B、C和E组均存在显著差异(P<0.01),三周后实验组抗体效价降低,表明IMB-GSTAb具有一定的免疫增强作用,能较快的诱导机体产生相应抗体。用不同剂量IMB-GSTAb皮下注射鸡只进行安全性试验,结果显示,当注射磁珠量达108 mg/只时,实验鸡生长未出现异常,剖检观察未发现病理学变化,证明IMB-GSTAb具有良好的生物安全性。