论文部分内容阅读
目的:我课题组经多年研究筛选得到的香菇C91-3菌株,其菌丝体发酵液蛋白LFP91-3经抗肿瘤活性测定,证实其不仅具有体内抑制肿瘤生长作用还具有显著的体外直接杀伤肿瘤细胞的作用。本实验旨在对LFP91-3中的蛋白质组分进行分离纯化和初步鉴定,以获得更加高效抗肿瘤活性蛋白,以深入了解香菇C91-3菌丝体发酵液的抗肿瘤作用和作用机制,为临床应用打下良好基础。方法:利用生物工程发酵技术大量获得香菇C91-3菌丝体发酵液[1],通过盐析、透析、冻干、DEAE- sepharose FF离子交换层析对发酵液的粗蛋白LFP91-3进行离子交换层析分离,用考马斯亮蓝法测定各管洗脱液的蛋白浓度,并依此绘制洗脱曲线。根据洗脱曲线用SDS-PAGE电泳方法测定各管洗脱液中的蛋白质纯度和蛋白质的分子量。将蛋白成分单一的洗脱液收集冷冻干燥,调整浓度为5ug/ml、10ug/ml、15ug/ml,用四甲基偶氮唑蓝比色法（MTT）测定不同浓度单一蛋白对S180、H22肿瘤细胞作用24小时、48小时、72小时的体外生长抑制活性;流式细胞仪检测5ug/ml,10ug/ml,15ug/ml单一蛋白对S180、H22肿瘤细胞作用24小时,诱导肿瘤细胞的早期凋亡率和晚期凋亡率以分析其可能的抗肿瘤机制;采用Caspase-3分光光度法检测Caspase-3在S180、H22细胞中的活性。经SDS-PAGE电泳,切割离子交换层析所得单一蛋白条带,用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI—TOF—MS）测定单一蛋白的肽质量指纹谱（PMF）,通过在NCBI数据库中查询识别的方式对此单一蛋白进行初步鉴定。结果:经盐析、透析、冻干得到香菇C91-3菌丝体发酵液粗蛋白LFP91-3冻干粉,通过DEAE-Sepherose FF离子交换层析,0-0.5MNaCl梯度洗脱后,Microsoft Excel软件绘制洗脱曲线,得到4个洗脱峰;根据洗脱曲线用SDS-PAGE电泳测定洗脱峰Ⅳ各管洗脱液中蛋白质成分单一,分子量16KD左右,为离子交换层析得到的单一蛋白;MTT法显示该蛋白能在体外明显抑制S180、H22肿瘤细胞活性,其生长抑制率随单一蛋白作用时间的延长和浓度的增加而升高,呈时间和浓度的依赖性。单一蛋白作用于S180、H22细胞,作用时间24、48、72小时,作用浓度5ug/ml、10ug/ml、15ug/ml ,S180和H22细胞活性最低抑制率分别为9.66±0.30和6.34±0.05。最高生长抑制率分别为67.23±0.42和33.64±0.85;该蛋白对S180细胞的生长抑制作用更为显著。随着作用时间的延长,抑制率明显增加,P<0.05。Annex in/PI双染色法染色,以流式细胞仪检测肿瘤的凋亡率结果表明单一蛋白能诱导肿瘤细胞的凋亡,浓度为5ug/ml、10ug/ml、15ug/ml的单一蛋白作用于S180、H22细胞24小时,随着蛋白浓度的增加,S180细胞的早期凋亡率分别为0.82%、0.86%、1.95%, H22细胞的早期凋亡率分别为0.41%、0.79%、1.78%,肿瘤细胞的早期凋亡率随着单一蛋白的作用浓度而增加,表现出剂量-效应关系;单一蛋白作用S180、H22细胞后Caspase-3活性各个时间段相比也有显著差异（P<0.05）。随着作用时间的延长Caspase-3活性逐渐增加,单一蛋白诱导24 h后即可提高S180、H22细胞Caspase-3活性,分别达到12.27±0.167和6.93±0.200,时间延长到72h后,S180和H22细胞Caspase-3活性分别达到测定最高值31.93±0.200和24.6±0.367;MALDI—TOF—MS测定单一蛋白PMF,经NCBI数据库检索无吻合蛋白。初步证实其是一未知蛋白。结论:香菇C91-3菌丝体发酵液的粗蛋白LFP91-3经盐析、透析、冻干、DEAE- sepharose FF离子交换层析分离得到四组蛋白,其中第四组经SDS-PAGE电泳为单一成分蛋白,分子量为16kDa左右,体外对S180,H22细胞的生长具有较强的抑制作用。试剂盒检测发现Caspase-3活性的升高,并且具有时间依赖性。预测该蛋白可能通过诱导Caspase-3蛋白表达进而诱导肿瘤细胞凋亡。经质谱测定、NCBI数据库检索没有查到吻合蛋白,初步证实其是一未知新蛋白。